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       【摘要】 
       目的研究中华补血草根提取物(Limonium sinense Ktze root extract, LSE)的抗肿瘤活性。方法MTT法测定体外培养的肿瘤细胞HepG2的存活率，检测LSE对离体细胞增殖的影响;建立小鼠移植性黑色素瘤模型，检测LSE对荷瘤小鼠的抑瘤作用并测定小鼠脾脏指数和胸腺指数。结果0.2～0.8 mg/ml LSE可剂量抑制肿瘤细胞HepG2的增殖;200，400，800 mg/kg LSE对荷瘤小鼠实体瘤具有显著抑制作用，抑制率分别为18.6 %、40.7 %及49.0 %。且各剂量组小鼠胸腺指数高于模型组小鼠。结论LSE具有显著抗肿瘤活性和一定免疫调节作用。
       【关键词】  中华补血草; 抗肿瘤活性; 免疫调节
       白丹花科补血草属植物中华补血草Limonium sinense (Girard) Kuntz，又名匙叶草、盐云草、海菠菜、海赤芍等，为多年生泌盐草本植物，喜生于盐渍化的低洼湿地上，广泛分布于我国东北、华北等地区，尤以江苏省沿海滩涂分布甚广[1，2]。植物蕴藏量大，资源丰富，在局部地区已开始人工栽培，人工栽培条件下植物生长迅速，产量高 [3]。中华补血草化学成分十分丰富，含有维生素、多糖、鞣质、多元酚、黄酮类、脂肪族化合物，以及氨基酸、矿物质等多种物质成分[4，5]，据记载：中华补血草，以根入药，功能祛湿，清热，止血，可用于治疗血淋、湿热便血、痔疮下血、血热、月经过多等症，民间流传使用中华补血草治疗功能性子宫出血症 [4]，对其药理作用的研究也一直集中在其抗菌止血方面。
       有学者研究发现，中华补血草同属植物——二色补血草的水溶性多糖成分能有效抑制离体培养的肝癌细胞的生长 [6]，而有关中华补血草的抗肿瘤作用，尚无研究报道。本课题组通过建立小鼠移植性黑色素瘤模型，采用MTT试验的方法，探讨中华补血草全根提取物的抗肿瘤活性，取得了初步成果。
       1 材料
       1.1 中华补血草根提取物(LSE)的制备中华补血草采集于江苏省盐城滩涂，由江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室于延球副教授鉴定。取中华补血草干燥全根100 g，粉碎，用蒸馏水提取1～3次，合并提取液，浓缩、干燥，得棕色干粉(LSE)32.9 g(得率32.9 %)。
       1.2 实验动物ICR小鼠，标准体重，购自南京大学实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2002-0031;C57小鼠，标准体重，购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SYXK(苏)2002-0045。
       1.3 试剂MTT(四甲基噻唑蓝)，德国Sigma公司生产;FBS(胚胎牛血清)，美国Hyclone公司产品;DMEM培养基，美国Gibco公司产品;其他试剂均为国产分析纯。
       2 方法
       2.1 最大耐受量实验标准体重ICR小鼠20只，分为正常对照组及LSE组，每组10只。LSE用生理盐水配制成1 g/ml LSE液。LSE组小鼠以上述LSE液按0.25 ml/10g体重灌胃给药(相当于25 g提取物/kg体重)，正常对照组小鼠以同样体积生理盐水灌胃，给药后连续观察14 d，考察LSE的毒性。
       2.2 离体培养肿瘤细胞模型的建立将对数生长期的肿瘤细胞HepG2用含10%胚胎牛血清的DMEM培养基制备成5×104个/ml的细胞悬液，按每孔100 μl接种于96孔板，37 ℃，5 % CO2温育24 h后，分组给药，给药终浓度为0.05，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/ml的LSE。给药后继续培养。
       2.3 MTT试验将“2.2”中给药后培养48 h的肿瘤细胞HepG2，弃去上清，加入无血清培养基100 ml,MTT(5.0 mg/ml)20 μl，37 ℃孵育4 h，弃去上清，每孔加入100 μl DMSO，振荡数分钟，在Bio-RAD 680全自动酶标仪上读取570 nm处吸光度值(OD570 nm)。以OD570 nm值表示细胞存活率，据此检测肿瘤细胞HepG2的存活率。
       2.4 小鼠移植性黑色素瘤模型的建立取C57小鼠50只，于每只小鼠右侧腋窝皮下接种B16-F10黑色素瘤细胞悬液0.1 ml(5×105个细胞)。随机分成模型(Control)组，环磷酰胺(CTX，20 mg/kg，阳性对照)组，200，400，800 mg/kg LSE组，每组10只。分别用生理盐水、相应剂量CTX和LSE灌胃，1次/d，连续灌胃14 d。
       2.5 抑瘤率测定将“2.4”项中的C57小鼠，于末次给药后24 h处死，剥取瘤块，用滤纸吸干后，测量瘤的体积，并计算抑瘤率。
       抑瘤率(%)= ( 1-实验组瘤体积对照组瘤体积)×100%
       2.6 脾脏指数和胸腺指数测定“2.4”项中的C57小鼠，于末次给药后24 h处死，称量脾脏和胸腺重量，并计算脾脏指数和胸腺指数。
       2.7 器官指数的计算心、肝、脾、肺、肾、胸腺等各器官指数按下列公式计算：
       器官指数(%)=器官重量小鼠重量×100%
       2.8 统计方法进行单因素方差分析(one way analysis of variance, one way ANOVA)，各处理组的组间差异采用SNK-q(Student Newman Keuls-q)检验进行比较。显著性水平取a=0.05。
       3 结果
       3.1 LSE最大耐受量试验LSE最大耐受量试验结果见表1。小鼠灌胃给药后14 d中，两组动物均无死亡。其中LSE组小鼠外观正常，皮肤光滑，色泽光亮，心指数、肝指数、脾指数、肺指数等均处于正常范围，表明LSE对小鼠基本无毒性作用;而胸腺指数显著增大，提示其具有一定的免疫增强作用。
       3.2 对离体培养的肿瘤细胞HepG2增殖的影响MTT法检测离体培养的肿瘤细胞HepG2存活率，发现0.20～0.80 mg/ml LSE可显著抑制肿瘤细胞HepG2的增殖，且随着剂量增大，抑制作用增强，即抑制作用呈剂量依赖方式(见图1)，提示一定剂量的LSE有明显的体外抗肿瘤活性。表1 中华补血草提取物最大耐受量实验
       3.3 对移植性黑色素瘤小鼠实体瘤生长的影响由表2可见，LSE各组小鼠瘤体积明显减少。计算不同剂量LSE的抑瘤率，发现各剂量LSE对瘤块的抑制率分别为18.6 %，40.7 %及49.0%，其中高剂量组(800 mg/kg LSE)的抑瘤率和阳性对照环磷酰胺组无显著差异(见图2)。即LSE可以剂量依赖性抑制黑色素瘤细胞B16-F10在体内的增殖，表明LSE具有显著抑制动物肿瘤生长的作用。表2 中华补血草全根提取物对移植性黑色素瘤小鼠瘤体积的影响表3 中华补血草提取物对移植性黑色素瘤小鼠脾指数及胸腺指数的影响
       3.4 LSE的免疫调节作用脾指数和胸腺指数测定结果表明，与模型组小鼠相比，LSE各剂量组小鼠脾指数均显著增加，并且800 mg/kg LSE组小鼠脾指数高于400 mg/kg和200 mg/kg LSE组;LSE各剂量组小鼠胸腺指数均高于模型组小鼠，其中800 mg/kg LSE剂量组小鼠胸腺指数最高(见表3)。进一步分析发现，LSE各剂量组小鼠脾指数和胸腺指数均明显高于环磷酰胺组。上述结果提示LSE具有一定的刺激脾和胸腺增殖，增进免疫器官功能的作用。
       4 讨论
       本研究首先对中华补血草全根提取物毒性进行了考察，小鼠最大耐受量实验结果表明，该植物毒性较低，且能增进正常小鼠的免疫功能。
       本研究着重从离体细胞和动物体两个水平全面考察了滩涂植物中华补血草的抗肿瘤活性。采用MTT法检测LSE对离体培养的肿瘤细胞HepG2的体外增殖的影响，结果表明，LSE可以剂量依赖方式抑制离体培养HepG2的增殖，显示其明显的体外抗肿瘤作用。运用移植性黑色素瘤小鼠实体瘤模型，考察LSE对整体动物在体肿瘤生长的影响，发现一定剂量LSE对移植性黑色素瘤小鼠实体瘤生长具有抑制作用，表明LSE具有显著抑制在体动物肿瘤生长的作用，即中华补血草具有抗肿瘤活性。
       此外，LSE对整体动物在体肿瘤生长的抑制试验发现：LSE各剂量组荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数明显高于环磷酰胺组，进一步证实了LSE具有对抗免疫抑制、改善免疫机能的作用。
       上述结果表明，中华补血草毒性较低;具有显著的抗肿瘤活性，同时能够显著增强机体免疫功能，作为天然植物药，具有多环节、多靶点作用的特点，可通过多种抗肿瘤机制发挥其抗肿瘤作用，因此具有抗肿瘤植物药的潜在开发前景。
       鉴于在肿瘤的临床治疗中，放、化疗法在杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常细胞产生明显损伤，特别是对骨髓细胞等增殖旺盛的细胞杀伤作用明显，出现显著的骨髓抑制，抑制造血过程，导致外周血细胞减少，患者免疫机能下降，进而引发感染和出血等并发症。而中华补血草具有刺激动物造血的功能[4]，并且在我们的前期研究中，亦已证实中华补血草对正常细胞具有显著保护作用 [7～10]，即中华补血草可以通过降低抗肿瘤药物的骨髓抑制而促进造血，保护正常细胞，从而降低抗肿瘤药物对正常组织细胞的毒性作用。
       总之，中华补血草毒性低，同时具有刺激造血机能、增进免疫以及对正常细胞的保护作用，能多途径、多渠道对抗抗肿瘤药物的毒性作用、起到减毒增效作用，且其本身也具显著抗肿瘤活性，与现有抗肿瘤植物药或联合治疗药物相比，有着更强大的潜在优势，预示中华补血草作为抗肿瘤药物的联合治疗药物或直接作为抗肿瘤药物的药源植物的极大可能。
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       LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL .21 NO.4时珍国医国药2010年第21卷第4期