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       【摘要】 
       目的优选微波提取天麻素的最佳提取工艺。方法通过正交设计的方法，采用连续微波辐射方法进行微波萃取工艺的优化;以天麻素含量为评价指标，采用HPLC测定天麻素的含量。结果微波法提取的最佳工艺条件为70%甲醇溶液，温度60℃，固液比为1∶20，提取时间9 min，功率400 W。结论与传统乙醇加热回流提取法相比，微波提取能大大节省提取时间，降低提取成本，并有很好的天麻素提取率。
       【关键词】  微波萃取; 天麻; 天麻素; 正交实验
       天麻(Rhizoma Gastrodiae)又称赤箭，为兰科植物Gastrodia elata Bl.的干燥块茎，主产于云南、陕西、四川、贵州、湖北等地[1]。含天麻素、天麻苷元等酚类化合物和甾醇、有机酸、多种氨基酸、多糖、核苷、淀粉等成分[1,2]。临床用于治疗头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫抽搐、破伤风等症[3]。考察天麻及其制剂的质量多以天麻素为指标，所以天麻的提取方法至关重要。
       传统的热提取法加热时间长，耗能多。浸泡提取法提取周期长，提取效率差，提取剂消耗量大。微波萃取法是利用微波能来提高提取效率的一种新技术。微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点[4]。微波提取方法与传统回流法比较，具有设备简单、适用范围广、提取效率高、重现性好、节约时间、节省试剂、污染小等特点，能有效地提高提取物的得率[5]，用微波萃取中药黄芪和景天中有效成分，均收到良好的效果[6，7]。本文通过正交设计考察微波功率、辐射时间、溶剂浓度、固液比、提取温度条件对提取效果的影响，优选出微波提取天麻素的最佳工艺条件。
       1 材料与仪器
       野生天麻药材(市售)，由遵义医学院药学系生药学教研室杨建文副教授鉴定为兰科植物天麻 Gastrodia elate B1.;天麻素对照品(中国药品生物制品检定所，批号110807-200205);乙腈(色谱纯);其流动相用水为二次蒸馏水;其他试剂均为分析纯。
       Angilent 1100系列高效液相色谱仪：美国Angilent公司，配备有四元混合泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱及二极管阵列检测器;MAS-II型常压微波合成/萃取反应工作站：上海新仪微波化学科技有限公司;AL204 电子天平：METTLER TOLEDO 公司;Anke TGL-16C型高速离心机：上海安亭科学仪器厂;艾柯DZG-303A型纯水仪：成都唐氏康宁科技有限公司。
       2 方法与结果
       2.1 正交实验设计在影响醇提的因素中，甲醇浓度、用量、提取时间、提取次数及提取温度为较重要的5个因素，考虑到实际操作的安全性，醇提次数定为1次，故选定甲醇浓度、用量、提取温度与时间作为考察因素，以天麻素含量为指标，应用 L9(34) 正交实验设计进行试验。因素水平安排见表1。表1 正交实验因素水平
       2.2 样品溶液的制备取天麻药材，粉碎，粉末过80目筛，80℃干燥1 h备用。精密称取干燥天麻粉末6.0 g，加入一定量的体积分数为70%的甲醇溶液，置于150 ml三颈瓶中，称定重量。浸泡2 h后，置于MAS-II型常压微波合成/萃取反应工作站中，装好冷凝管，按实验设计进行微波提取。冷却后，用70%甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤，取此滤液5 ml蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50 ml量瓶中，再用甲醇定容，过0.45 μm的微孔滤膜，得供试品溶液。取试样10 μl，重复进样3次，取面积平均值，线性方程计算含量。
       2.3 天麻素含量测定方法
       2.3.1 色谱条件色谱柱为Angilent Tc-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(V∶V=15∶85);检测波长：221 nm;流速：0.5 ml·min-1;柱温：25℃;进样量：10 μl。
       2.3.2 标准曲线的绘制精密称取在80℃减压干燥1 h的对照品21.4 mg，置于100 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为214 μg·L-1的对照品备用液。精密量取天麻素对照品备用液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度10.7，21.4，42.8，64.2，85.6，107.0 μg·L-1的天麻素对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，分别进样10 μl，以峰面积Y为纵坐标,天麻素浓度X为横坐标,经线性回归分析，得天麻素的回归方程为：Y =13.991X + 9.761 7，R2=0.999 9。表明天麻素对照液质量浓度在10.7～107 μg·ml-1内呈良好线性关系。高效液相色谱图见图1。
       a天麻素对照品 b野生天麻样品
       图1 高效液相色谱图
       2.3.3 精密度实验精密吸取对照品溶液10 μl，在上述色谱条件下，重复进样5次，结果测定天麻素峰面积相对标准偏差RSD为1.02%，表明仪器精密度良好。
       2.3.4 稳定性实验取同一供试品溶液，每隔2 h进样10 μl，共测6次，以天麻素面积计算得其RSD%为1.23%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
       2.3.5 重现性实验取同一批天麻样品，照样品溶液的制备方法制备5份，进行测定。以天麻素含量计算，RSD为0.97%。
       2.3.6 加样回收率实验精密量取已知含量的样品6份，分别加入一定量的天麻素对照品，按照样品溶液处理方法进行处理，测定天麻素含量，计算回收率，结果见表2。　表2 加样回收率实验结果
       2.4 正交实验结果正交实验结果见表3。将实验结果进行方差分析，按方差处理要求，各因素及相互作用结果的方差分析见表4。据表3的极差分析可知，在所考察的影响因素中，重要性依次为：A>D>B>C。A因素中A3> A2>A1，B因素中B3>B2>B1，C因素中C1> C3 >C2，D因素中D3>D2>D1。由于SSc最小，故以其作为误差进行方差分析。方差分析结果表明，A因素、D因素的影响有显著性意义;B因素、C因素的影响无显著意义。根据方差分析结果，确定最佳提取条件为A3B2C1D3，即加20倍量70%甲醇，在60℃，微波功率400W下，提取9 min。表3 正交实验结果表4 方差分析
       2.5 验证实验称取药材20 g，用筛选出的醇提工艺条件，即20倍量70%甲醇在400 W，60℃提取9 min，测定各评价指标的量(见表5)。 由表5结果可以看出正交设计筛选出的工艺是合理的。表5 验证实验结果%
       2.6 微波法与药典法提取天麻素结果比较取同批样品进行实验，微波法用70%甲醇做溶剂，在60℃下，微波时间9 min，溶剂体积为120 ml，微波功率400 W。2005版《中国药典》法用乙醇做溶剂，加热回流3h，溶剂体积为500 ml。每个方法均做6个平行样，每个试验取样品均为10.0 g，其它条件相同，提取结果见表6。结果表明，微波萃取法提取产率高于药典法，且实验精密度高。表6 微波法与药典法提取天麻素结果比较
       3 讨论
       研究得出以天麻为原料，微波萃取天麻素的工艺路线：体积分数为70%甲醇，固液比为1∶20，功率400W，微波时间9 min，提取温度60℃。实验证明该工艺路线合理，分析方法准确、可靠。
       从实验结果来看，微波萃取法的提取率比传统热提取方法提高了2.29倍，效果非常明显。同时，提取时间由3h缩短为9min左右，大大提高了提取效率。因此，微波萃取可对天麻有效成分的提取起到显著的促进作用。
       在对甲醇浓度进行单因素实验时发现，天麻素的提取得率随着甲醇浓度的升高呈先上升后下降的趋势，当甲醇浓度为70 %时，天麻素的提取得率达到最大。
       《中国药典》2005年版中天麻项下含量测定方法以乙腈-0.05%磷酸溶液(V∶V=3∶97)为流动相，但在本文的研究中发现样品不能很好地分离，因此调整二者的比例，当其比例为(V∶V= 15∶85)时能得到很好的分离。
       此实验结果为中药有效成分的测定提供了一种新的样品前处理方法，而且对微波萃取应用于大生产提供了参考，节约了时间和溶剂，有着广阔的应用前景。
       【参考文献】
         　[1] 国家中医药管理局(中华本草)编委会.中华本草,第8卷[M].上海:上海科学技术出版社,1999:716.
       
       [2] 金文珊,田德蔷.天麻的药理和化学研究概况[J].中药研究与信息,2000,2(6):21.
       
       [3] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:39.
       
       [4] 曾昭钧,李香文.微波有机化学进展[J].沈阳药科大学学报,1999,5(10):304.
       
       [5] 张代佳,荆侍斌,修志龙，等.微波技术在植物胞内有效成分提取中的应用[J].中草药,2000,31(9):附5.
       
       [6] 王 莉,刘志勇,鲁建江，等.黄芪多糖的微波提取及含量测定[J].中医药学报,2001,29(6)：35.
       
       [7] 孙 萍,李 艳,杨秀菊.景天多糖的微波提取及含量测定[J].时珍国医国药,2003,14(2)：69.