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       【摘要】 
       目的优选葛根总黄酮的提取工艺。方法采用水浴回流、微波和超声波辅助3种方法提取葛根总黄酮，正丁醇萃取纯化。结果微波辅助提取所得总黄酮提取率最高，提取率为91.68%，纯化后，总黄酮纯度为87.56%;超声波辅助提取次之，提取率为87.88%;水浴回流提取最低，提取率为85.35%。结论微波辅助提取法节能、高效，且污染小，具有应用前景。
       【关键词】  葛根; 总黄酮; 水浴回流法;微波法; 超声波法
       Extraction Technology Comparison of Total Flavonoids from Radix puerariae
       GAN Lin1， ZHOU Fang2， ZHANG Yuefei1， CHI Ruan1*
       (1. School of Chemical Engineering & Pharmacology, Wuhan Institute of Technology, Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education, Hubei Key Lab of Novel Reactor & Green Chemical Technology;2.School of Internation, Wuhan University of Engineering,Wuhan, 430073, China)
       Abstract：Objective To optimize the extraction process of total flavonoids from radix puerariae. MethodsWater circumfluence, microwave-assisted, ultrasonic wave-assisted and n-Butanol were employed in the extraction and purification processes of total flavonoids. ResultsThe extraction rate of total flavonoids obtained by microwave-assisted was higher than the others , the yield was 91.86% , and the purity was up to 87.56% after purification. The extraction rates of ultrasonic wave-assisted and water circumfluence were 87.88%,85.33%, respectively. ConclusionMicrowave-assisted method is energy-saving, efficient and has little pollution, which can be used to extract total flavonoids.
       Key words：Radix Puerariae; Total flavone; Water circumfluence; Microwave; Ultrasonic wave
       葛根属豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的块根[1，2]，其所含有效成分总黄酮能降低心肌耗氧量，增加冠脉、脑血管血流量，明显缓解心绞痛、抗心律失常等[3]，对防治心肌梗塞、心律失常等也有重要疗效[4，5]。
       葛根总黄酮的提取通常采用水提法和有机溶剂提取法[6]。本实验以乙醇为溶剂，用紫外分光光度法分析葛根总黄酮的含量，比较了水浴回流提取、微波辅助提取和超声波辅助提取3种提取方法，为确定葛根总黄酮的提取工艺提供实验依据。
       1 材料与仪器
       1.1 原料和试剂 葛根购自湖北三九大药房，粉碎过20目筛备用;葛根素对照品购自中国药品生物制品检定所;所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
       1.2 仪器XMTB数显恒温水浴锅，武汉市琴台医疗器械厂产品;XH-100A微波催化合成/萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司产品;KQ-250DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品;UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司产品; Agilent 1100系列高效液相色谱仪，美国Agilent 公司产品。
       2 方法
       2.1 分析方法
       2.1.1 标准曲线的制作精密称取葛根素对照品5.5 mg，用95%乙醇溶解并定容于50 ml容量瓶中，得0.11 mg/ml的葛根素标准溶液。准确吸取该标准溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml于10 ml容量瓶中，蒸馏水稀释定容，得系列对照品溶液。以1.0 ml 95%乙醇加水至10 ml作空白对照，于250 nm处[7]测定各对照品溶液吸光度，得到吸光度A与总黄酮质量浓度C(mg/ml)的线性回归方程：C=0.015 02A-0.000 041，r=0.999 92。
       2.1.2 葛根中总黄酮含量的测定称取干燥葛根10.0 g，加入200 ml 80%乙醇，在80℃水浴下回流提取2 h，抽滤。同条件下反复提取6次，得葛根总黄酮提取液，测定提取液中总黄酮浓度并计算葛根中总黄酮含量η为8.4%。
       2.1.3 葛根提取液中总黄酮含量的测定准确吸取葛根总黄酮提取液1 ml于50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，按上述“2.1.1”项的方法操作，测定吸光度，根据线性回归方程计算各提取液中总黄酮浓度。
       葛根总黄酮提取率：X=C×50×25010×1000 η×100%
       其中：X—总黄酮提取率(%);C—由线性回归方程计算出的提取液中总黄酮浓度(mg/ml);50—稀释倍数;250—提取液体积(ml);10—葛根质量(g);1000η—葛根中总黄酮含量(mg/g)。
       2.1.4 色谱条件 Inertsil ODS-3C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇—水(25∶75);柱温30℃;流速1.0 ml/min;检测波长250 nm;进样量10 μl。
       2.2 实验方法
       2.2.1 水浴回流提取法准确称取干燥葛根10.0 g，放入三口圆底烧瓶中，加入乙醇，水浴下回流提取后抽滤，滤液冷却至室温，用同浓度的乙醇定容至250 ml，得葛根总黄酮提取液，测定该提取液中总黄酮浓度。
       2.2.2 微波辅助提取法准确称取干燥葛根10.0 g，放入三口圆底烧瓶中，加入体积分数为80%的乙醇，微波萃取后抽滤(微波萃取示意图见图1)，滤液冷却至室温，80%乙醇定容至250 ml，得葛根总黄酮提取液，测定该提取液中总黄酮浓度。
       2.2.3 超声波辅助提取法准确称取干燥葛根10.0 g，放入三口圆底烧瓶中，加入80%乙醇，超声波辅助提取后抽滤，滤液冷却至室温，80%乙醇定容至250 ml，得葛根总黄酮提取液，测定该提取液中总黄酮浓度。
       2.2.4 正丁醇萃取法[8]分别称取各优化工艺下的提取物2 g，40 ml蒸馏水溶解，用200 ml水饱和的正丁醇萃取，将正丁醇相减压浓缩、真空干燥，得黄酮粉末，称重，测定总黄酮的浓度，计算产品纯度及产率。
       图1 微波萃取仪示意图
       3 结果
       3.1 水浴回流提取法优化工艺的确定采用正交实验设计，选取提取时间(A)、乙醇浓度(B)、提取温度(C)、液固比(D)为考察因素，以总黄酮提取率为考察指标，采用L9(34)表。正交实验结果见表1。表1 L9(34)水浴回流提取法的正交实验结从表1结果可以看出，各因素对提取效果的影响作用大小依次为C(提取温度)﹥A(提取时间)﹥B(乙醇浓度)﹥D(液固比)，其中提取温度对葛根总黄酮的提取效果影响最大，而液固比和乙醇浓度对提取无显著影响。极差分析结果表明，水浴提取葛根总黄酮的优化工艺为A3B2C3D3，即：提取时间120min，乙醇浓度80%，提取温度80℃，液固比20∶1。
       按水浴回流提取法的优化工艺进行验证，即按因素组合A3B2C3D3平行提取3次，提取率分别为84.92%，85.16%，85.98%，RSD为0.65%，该工艺稳定可行，葛根总黄酮的平均提取率为85.35%。
       3.2 微波辅助提取法优化工艺的确定根据水浴回流提取法的实验结果，以80%乙醇为溶剂时总黄酮提取率最高，故微波辅助提取以80%乙醇为溶剂，选取提取时间(A)、微波功率(B)、提取温度(C)、液固比(D)为考察因素，以葛根总黄酮提取率为考察指标，采用L9(34)表，正交实验结果见表2。表2 L9(34)微波辅助提取法的正交实验结果由表2结果可知，各因素对提取效果的影响作用大小依次为A(提取时间)﹥C(提取温度)﹥B(微波功率)﹥D(液固比)，其中提取时间对葛根总黄酮的提取效果影响最大，而液固比对提取无显著影响。极差分析结果显示，微波辅助提取法的优化工艺为A3B2C3D3，即：提取时间60 min，乙醇浓度80%，提取温度80℃，液固比20∶1，微波功率800W。
       按因素组合A3B2C3D3平行提取3次进行验证，提取率分别为92.15%，90.26%，92.63%，RSD为1.37%，可见该工艺稳定可行，葛根总黄酮的平均提取率为91.68%。
       3.3 超声波辅助提取法优化工艺的确定采用正交实验设计，选取提取时间(A)、提取温度(B)、超声波功率(C)为考察因素，以总黄酮提取率为考察指标，采用L9(33)表。正交实验结果见表3。表3 L9(33)超声波辅助提取法的正交实验结果由正交实验结果可知，各因素对提取效果的影响作用大小依次为A(提取时间)﹥B(提取温度)﹥C(超声波功率)，其中提取时间对葛根总黄酮的提取效果影响最大，而超声波功率对提取无显著影响。极差分析结果显示，超声波辅助提取葛根总黄酮的优化工艺为：A3B3C2，即：提取时间60 min，乙醇浓度80%，提取温度80℃，液固比20∶1，超声波功率50%。
       按因素组合A3B3C2平行提取3次进行验证，提取率分别为88.12%，87.56%，87.95%，RSD为0.33%，可见该工艺稳定可行，葛根总黄酮的平均提取率为87.88%。
       3.4 总黄酮纯度的比较三种优化工艺所得提取物萃取前后的HPLC色谱图见图2，提取物总黄酮纯度见表4。
       a – 对照品 b – 水浴回流提取物(萃取前)
       c – 微波提取物(萃取前) d – 超声波提取物(萃取前)
       e – 水浴回流提取物(萃取后) f – 微波提取物(萃取后)
       g – 超声波提取物(萃取后)
       图2 HPLC图
       表4 3种优化工艺所得提取物的总黄酮纯度%
       方法萃取前纯度萃取后纯度 产率水浴回流提取 50.52 87.79 32.36 微波辅助提取 49.82 87.56 56.74 超声波辅助提取 42.86 86.52 44.32
       比较图2中b、c、d可知，3种提取方法中，水浴回流提取法所得提取物的杂质相对较少，微波提取物杂质相对较多。比较图2中e、f、g可知，各提取物经正丁醇萃取后，所含杂质明显减少，且基本相同。因此，虽然微波提取物杂质较水浴多，但是经正丁醇萃取后，微波提取物的杂质明显减少，与萃取后的水浴提取物杂质基本相同，所以采用微波辅助提取葛根总黄酮不会影响后续分离工作。
       由表4可以看出，萃取前，水浴回流提取物纯度较高，萃取后的各提取物纯度相近，差别不大，与HPLC色谱图显示的结果一致。各产品产率以微波提取物最高，超声波提取物次之，水浴回流提取物最低，所以综合考虑产品纯度及产率，以微波辅助提取法最优。
       3.5 葛根总黄酮3种提取方法的比较 3种提取方法在优化工艺条件下的平均提取率见表5。表5 3种提取方法优化工艺条件下提取率的比较
       在葛根总黄酮的提取中，水浴回流提取法以加20倍乙醇，80℃下提取120min 的工艺效果为佳，平均提取率85.35%，而微波辅助提取法和超声波辅助提取法则以加20倍乙醇，80℃下提取60min 的工艺效果为佳，经优化工艺验证其平均提取率分别为91.68%，87.88%。显然，这两种提取方法优于水浴回流提取法，不仅提取率相对较高，还大大缩短了提取时间。可见，在常规提取过程中，施加微波辐射和超声场均能有效加速总黄酮的溶出。
       微波辅助提取法与超声波辅助提取法的提取时间相同，提取率相近，但从环境保护来说，微波辅助提取法优于超声波辅助提取法，因为超声波辅助提取过程中会产生噪音，污染环境，不适合大批量生产。
       比较3种方法优化工艺下所得提取物萃取前后的HPLC色谱图、总黄酮纯度及产率可知，虽然水浴回流提取物杂质相对较少，但是经过正丁醇萃取后，各提取物所含杂质及总黄酮纯度均相近，产率以微波提取物最高，所以微波法优于其他两种方法。
       比较上述3种提取方法，从生产成本和环境保护出发，微波辅助提取法优于其他两种方法;从产品纯度来看，微波提取物的总黄酮纯度较高，与水浴回流提取物的总黄酮纯度相近，差别可忽略不计。综合考虑生产成本、环境因素及产品纯度和产率，微波辅助提取法具有高效性、污染小、节能、操作简便等优点，更适合用于葛根总黄酮的提取。
       4 结论
       本实验比较了葛根总黄酮的水浴回流提取、微波辅助提取和超声波辅助提取3种方法，结果表明，微波辅助法优于其他两种方法，其优化工艺为：提取时间60min，乙醇浓度80%，提取温度80℃，液固比20∶1，微波功率800 W，提取率为91.68%。提取物经正丁醇萃取后，所得产品的总黄酮纯度为87.56%。
       将微波辅助提取法与水浴回流提取法、超声波辅助提取法作了比较。相比水浴回流法，微波辅助法有提取速度快，提取率高的优点;相对于超声波辅助法来说，微波辅助法有节能、环保的优点。说明微波辅助提取法在保证相对较高提取率的同时还有节能、环保的优势，对于葛根总黄酮提取的工业生产有更高应用价值，在天然产物有效成分的提取方面有更广阔的应用前景。
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