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       【摘要】 
       目的探讨虎杖苷对非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗(IR)以及血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法健康雄性SD大鼠44只，随机分为正常组(A)和模型组(M)，模型组给予高脂饲料喂养8周，造模成功后将模型组随机分为5组：空白模型组(B)、虎杖苷高剂量组(C1)、虎杖苷中剂量组(C2)、虎杖苷低剂量组(C3)、非诺贝特组(D)，每组7只，高脂饲料持续8周后，A组、B组予以生理盐水灌胃，5 ml/次，C1、C2、C3分别以160，80，40 mg·kg-1·d-1虎杖苷混悬液灌胃，D组以100 mg·kg-1·d-1非诺贝特混悬液灌胃。持续4周后处死动物,分离血清，检测、计算各组大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FNS)、胰岛素抵抗指数(IRI)、胰岛素敏感指数(ISI)、TNF-α水平。结果虎杖苷高剂量组与模型组IRI、ISI、TNF-α水平存在显著差异(P<0.05，P<0.01)，且在改善IR方面虎杖苷高剂量组优于西药对照组(P<0.01)。结论虎杖苷能改善NAFLD大鼠体内IR状态，降低TNF-α水平，是其治疗NAFLD的可能作用机制。
       【关键词】  虎杖苷; 非酒精性脂肪肝; 胰岛素; 血清肿瘤坏死因子
       非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是遗传-环境-代谢应激相关因素所致，以肝细胞内脂肪堆积为主的病理综合征，随着社会经济发展，NAFLD患病率迅速增高，现已成为危害人类健康的三大肝病之一，其与胰岛素抵抗及其相关的代谢综合征和遗传易感性密切相关，临床尚无理想的治疗药物，本文主要研究中药提取物虎杖苷对非酒精性脂肪肝模型大鼠的治疗作用，并从胰岛素抵抗(IR)以及血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)影响探讨其可能作用机制。
       1 材料
       1.1 动物健康雄性SD大鼠44只，体质量(200±10)g，SPF级，由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号：0035578)。
       1.2 药物及试剂虎杖苷(98.63%，HPLC，购自江苏泽朗医药科技有限公司)，非诺贝特(国药准字H31021491，批号070310，购自南方医科大学附属南方医院)。胆固醇购自广州威佳生物科技有限公司，ELISA试剂盒购自广东达晖生物科技有限公司，猪油购于广州加益食品有限公司，大鼠基础饲料由南方医科大学实验动物中心提供，高脂饲料由南方医科大学实验动物中心加工生产。
       2 方法
       2.1 动物模型的建立和分组健康雄性SD大鼠44只，体质量(200±10)g，SPFA级，称重后分笼喂养，每笼4只，标号，饲养于南方医科大学中医药学院实验动物中心。正常喂养1周后，随机分为两组，正常组(A)和模型组(M)，正常组给予标准饲料，模型组给予高脂饲料(高脂饲料配制：10%猪油+2%胆固醇+88%标准饲料)喂养，8周后，分别从正常组和模型组随机挑选1只，取肝脏做病理切片，证实非酒精性脂肪肝形成。再将模型组随机分为5组：空白模型组(B)、虎杖苷高剂量组(C1)、虎杖苷中剂量组(C2)、虎杖苷低剂量组(C3)、非诺贝特组(D)，每组7只，组间大鼠体重差异无显著性(P>0.05)。正常对照组以标准饲料喂养，其余高脂饲料喂养。喂养期间，实验动物自由饮水和进食，动物房保持安静，自然采光，温度25℃左右。喂养持续8周。
       2.2 给药8周后，A组、B组予以生理盐水灌胃，5 ml/次，C1、C2、C3分别以160,80,40 mg·kg-1·d-1虎杖苷混悬液灌胃，D组以100 mg·kg-1·d-1非诺贝特混悬液灌胃。持续4周。
       2.3 标本采集从造模开始算，第12周末当晚大鼠禁食不禁水12 h，次日上午称重后，用10%水合氯醛以0.35 ml/100 g浓度腹腔注射麻醉，腹主动脉取血8 ml，4℃，3 000 r/min离心10 min，分离血清。-20℃保存。迅速提取肝脏，称重，4℃生理盐水冲洗，在最大叶距边缘5 mm处取小块肝组织，中性福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色。
       2.4 指标检测空腹胰岛素(FNS)：放免法测定，将样本血清与抗血清混合反应，在加入标记抗原进行竞争性结合反应，反应完全后，加入PR免疫分离剂，分离出抗原抗体混合物，测定复合物的放射性(B)，计算各标准管的结合率(B/B0%)。做出标准曲线，查出样品浓度;空腹血糖(FBG)：采用酶法，严格按试剂盒说明书操作;计算胰岛素抵抗指数(IRI)=FBG×FNS/22.5，胰岛素敏感指数(ISI)=1/( FBG×FNS);TNF-α：ELISA法，按试剂盒操作步骤检测。
       2.5 统计分析计量资料采用±s表示，采用SPSS13.0软件单因素方差分析(One way ANOVA)，P<0.05表示差异具有统计学意义。
       3 结果
       3.1 各组FBG，FNS，IR，ISI比较结果见表1。
       3.2 各组TNF-α比较结果见表2。表1 虎杖苷对各组大鼠胰岛素抵抗的影响与正常组比较,*P<0.05，**P<0.01 ;与模型组比较,#P<0.05，##P<0.01;与西药对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01表2 虎杖苷对各组大鼠TNF-α的影响与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01 ;与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
       4 讨论
       胰岛素抵抗(IR)作为NAFLD的重要致病因素，参与NAFLD的发生和发展。研究表明大多数NAFLD患者均存在不同程度的IR。正常情况下，胰岛素和胰岛素受体结合后，胰岛素受体发生自身磷酸化引起胰岛素受体底物等磷酸化，把胰岛素的信号逐级传递下去，调节细胞的生长、发育及新陈代谢。IR状态下，胰岛素对脂肪代谢的调节作用减弱，是血中FFA增多，肝细胞内脂肪蓄积及肝细胞变性、肿大，形成脂肪肝[1]。近来细胞因子(cytokine,CK)在肝脏疾病中的作用已受到密切关注，从肝细胞脂肪变性到脂肪性肝炎、肝纤维化及肝硬化的进展中，CK都起重要作用。参与肝脏疾病的致炎CK很多，主要有TNF-α为其中重要的一种，它由乙醇及其代谢产物、内毒素、免疫复合物和病毒等多种物质诱导单核巨噬细胞产生，肝脏是其重要的靶器官，它介导着肝损伤与肝修复。在肝损伤早期，TNF-α又可通过激活核转录因子(NF-κB)触发其它CK或粘附分子的分泌(如IL-6、IL-8和细胞间粘附分子)从而致肠腔渗透性增加和ROS产生，加重炎症和损伤。有研究显示，NASH患者的肝、脂肪组织有TNF-αmRNA的过度表达，提示TNF-α在NASH的损肝CK网络中处于中心地位[2]，TNF-α可通过多种途径参与脂肪肝的病理变化，其中TNF-α及其受体在IR中起到的核心作用已被公认。TNF-α介导IR可能有以下几种途径[3]：①TNF-α可导致胰岛素受体底物的丝氨酸磷酸化，并使之成为胰岛素受体络氨酸激酶(IRK)抑制剂，从而抑制络氨酸磷酸化，影响胰岛素信号传导;②TNF-α激活磷酸蛋白磷酸酯酶(PP-2A)，从而导致丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)激酶去磷酸化，使之失活导致MAPK磷酸化活性下降，导致受体后胰岛素抵抗;③TNF-α可下调葡萄糖转运因子4(GLUT-4),上调葡萄糖转运因子1(GLUT-1)来增加基础葡萄糖的摄取，后者反馈性的一致GLUT-4的跨膜转运，抑制胰岛素刺激的葡萄糖转运;④TNF-α可促进脂肪细胞的分解及游离脂肪酸(FFA)的释放，FFA可介导IR，泛指IR与NAFLD的发展引起FFA的升高，FFA又使TNF-α升高，加强TNF-α的发生。
       虎杖，苦、平，功能祛风、利湿、破瘀、通经[4]。古今医家多利用虎杖配伍治疗肝病，尤其对于湿热型胁痛、黄疸等。NAFLA多由过食肥甘厚味，导致湿热蕴结中焦，临床以胁痛、黄疸、肥胖、舌苔厚腻，脉弦滑为特征，属中医“肝胀”“胁痛”“肥胖”等范畴。虎杖苷作为虎杖的其中一种重要活性成分，前期内外实验均表明具有降低血脂，减轻肝细胞脂肪变作用[5,6]。本实验表明，虎杖苷高、剂量组与模型组IRI、ISI、TNF-α水平存在显著差异(P<0.05，P<0.01)，且在改善IR方面虎杖苷高剂量组优于西药对照组(P<0.01)。其可能是通过减少TNF-α通过上述途径改善IR，增加胰岛素敏感性，减少肝脏脂肪沉积，从而减轻肝脏脂肪变，达到治疗NAFLD的目的。虎杖苷在虎杖根部的含量高达1.231%，且提取分离简单，随着药效和作用靶点的明确，具有很广阔的开发前景。我们将进一步深入研究虎杖苷降低TNF-α水平，改善IR状态的分子机制，并从多角度研究其治疗NAFLD的机制，为从中草药中开发治疗NAFLD的药物寻找科学依据。
       【参考文献】
         　[1] Ide T,Shimano H,YahagiN,et al.SREBPs suppress IRS-2-mediated insulin signalling in the liver[J].Nat Cell Biol,2004,6(4):3512.
       
       [2] 吴惠文,许瑞龄.枯否细胞在非酒精性脂肪肝肝炎发生中的作用[J].医学研究通讯，2005,34(12):53.
       
       [3] 徐可树,王 华,枫叶进.非酒精性脂肪肝的研究新进展[J].临床消化病杂志,2004,16(6):275.
       
       [4] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,2005:1329.
       
       [5] 朱立贤,金征宇.白藜芦醇苷对高脂血症大鼠血脂、一氧化氮及一氧化氮合酶的影响[J].中药药理与临床，2005,21(3):16.
       
       [6] 朱立贤,金征宇.白藜芦醇苷对高脂血症大鼠血脂代谢的影响及其抗氧化作用[J].中成药，2006,28(2):260.