文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的对课题组近年探索虚寒证-基因组的研究进行概述，展示预选的代谢类基因功能模块。方法在万人流行病学调查与典型虚寒证患者筛选的背景中，通过病证结合、普查辨证、家系分析、温针反证、温肾反证、动物实验等6种研究角度作基因表达谱芯片实验，并对结果进行分析。结果虚寒证的差异表达基因较为集中地出现于代谢与免疫两类基因，对这一趋势初步总结出虚寒证的代谢类候选基因，即LPL脂蛋白脂肪酶1等35条基因。结论虚寒证的发生涉及多种基因的异常表达，候选基因只是极其有限的第一步探索，对预选的代谢类基因功能模块的深入研究将有助于揭示寒证的本质。
       【关键词】  虚寒证; 基因组; 代谢; 基因芯片
       Metabolic Gene Function Module Preelected from Asthenia Cold Syndrome-Genome
       YANG Hongya, HAN Yuping, XU Quanyi, WANG Jing, WANG Miqu*
       (Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China)
       Abstract：ObjectiveTo summarize the latest development and achievement in genomes on asthenia cold syndrome, and demonstrate the metabolic gene function module preelected from asthenia cold syndrome-genome.MethodsA large-scale epidemic disease investigation involved 10,000 persons were carried out. By utilizing cDNA microarray and other modern techniques, the asthenia cold syndrome was studied from six aspects.ResultsResults of cDNA microarray experiments demonstrated that the differentially expressed genes of asthenia cold syndrome, two classes of genes were most frequently appeared, they were immune and metabolic genes. The first group of candidate metabolic genes for asthenia cold syndrome were preelected, among which 35 genes belonged to metabolism (such as LPL lipoprotein lipase 1). ConclusionAsthenia cold syndrome involves the abnormal expression of multiple genes, to preelect genes is only the first step in exploring its essence, but further study about the preelected metabolic gene function modules will be helpful to reveal the nature of cold syndrome.
       Key words： Asthenia cold syndrome; Genome; Metabolism; CDNA microarray
       寒证为八纲辨证之一，是中医鉴别疾病属性的一个大纲领。自1979年北京医学院梁月华[1]首先提出了“寒证本质研究”这一命题以来，寒证的科学基础研究至今已有30余年，从宏观到微观，从量表到实验，从植物神经到基因表达，从单个基因到多基因，从一条通径到多条通路，研究逐渐深入[2]，尤其是近年来人类基因组学、功能基因组学、基因芯片、生物信息学等方面的发展为深入研究寒证提供了新的思路和模式。本论文以课题组十余年来在国家自然科学基金项目“虚寒证的基因组研究及数学分析”等资助下的研究为主体，在虚寒证-基因组的系统研究背景下，通过6种方法，筛选出一批差异基因表达谱，其主要集中于代谢和免疫功能模块，现将代谢类基因功能模块的研究进展报道如下。
       1 背景：万人流行病学调查与典型虚寒证的筛选
       1.1 3 201例老年证候的流行病学调查研究虚寒证证候-基因组必须将其放到当今科学的大背景、中医临床的特定背景、肾虚人群的具体背景中去研究。为了精选出典型的虚寒证患者作基因芯片实验，课题组进行了各种层次、近万例的流行病学调查。虚寒证辨证要从中医源头创造的东方思维出发，从宏观整体证候行为着手。在中医诊断学专家严石林教授主持下，参考国家虚寒证诊断标准，最先编写了40个因子的虚寒证观察量表。具体操作从临床实用实际出发，对虚寒证的40个因子，逐项进行轻、中、重评分的细则研究。在成都、太原、重庆、内蒙古等地，进行3201例老年流行病学调查，调查以养老院为主，亦涉及到部分散在的老人[3,4]。
       1.2 2 900例东(成都市)西(波哥大市)方证候的比较研究以68项肾虚辨证问卷，对哥伦比亚波哥大市和中国成都市的疗养院、老年中心进行流行病学调查，两地共2 900例老年人被调查。同时对东西方两个城市进行频数分布、相关分析、秩和检验及聚类分析(变量聚类和样品聚类)等方面的比较研究。
       1.3 2 500例虚寒证用分层隐类的数理系统进行研究用香港科技大学计算机系张连文教授与课题组合编的《肾虚辨证与术数研究》，对太原、成都等6个地区进行了2 500例虚寒证的流行病学调查，提出了分层隐类法(Hierarchical Latent Class Models for cluster)的计算方法，最后得到启发式单爬山模型(heuristic single hill-climbing)，力求客观地、定量地刻划35个变量与变量之间的关系，在症状概率之间尽可能地反应大量存在的多重共线性关系(multicollinearity)及其协同关系。
       1.4 734例寒热表里虚实等八纲面上的流行病学调查为了普查面上一般疾病的证候八纲状况，课题组的诊断学专家反复编制了四诊特征问卷表，包括35类171个症状，如头面部8种症状等19类。每类的若干种症状，每种症状按无、轻、中、重，分别评分0，1，2，3。采用这一量表，以成都市彭州的通济镇、新兴镇两个山区镇为中心，及其各村的交通要点，共布点8个，在义诊中对734例患者作了寒热表里虚实等八纲面上的流行病学调查[5]。
       1.5 300例虚寒证专家系统与聚类分析的结合研究采用修订的40项因子虚寒证辨证量表，对成都市及其周边县区进行调查，结合专家系统辨证诊断虚寒证患者，从中选择高分段300例虚寒证进行分析。其中辨证因子出现频率高的依次是：畏寒89.7%、肢冷83.7%、夜尿76.7%、腰背发冷75.3%等，并对25个出观频率最高辨证因子进行聚类分析(SPSS软件)。
       2 方法：6种角度作基因芯片研究
       虚寒证证候-基因组作为一个复杂性的、前沿性的科学问题，决不是一个思路、一种角度、一类方法、一些实验、一时的研究就能弄清其“真面目”。对其“玄冥幽微”(《伤寒论·原序》)状态，近年课题组对虚寒证证候-基因组的研究以基因芯片为主要的研究方法，从虚寒证的病证结合、普查辨证、家系分析、温针反证、温肾反证、动物实验等6种研究角度努力探索。
       如从病证结合角度探索虚寒证骨关节炎8例的差异基因表达谱。在四川彭州新兴镇用40量表精选虚寒证的高分段患者，结合西医确诊为骨关节炎的8例，分别采其外周血10 ml/L回收白细胞，同步取当地正常人8例为对照组，用北京博奥生物芯片有限公司基因组芯片(22 000点)，提取mRNA、标记后，两组杂交，获得差异基因表达75条，其中已知功能的41条，与代谢相关基因6条[如ADP核糖基化因子4基因(NM_001660)]，占差异表达基因总数的14.6%。
       3 筛选：第1批虚寒证证候-基因组的候选基因
       3.1 筛选概述上述6类角度的基因芯片研究中，从实验得到虚寒证的差异表达基因谱一般为基因芯片总点数的1/25～1/7，在差异表达基因中已知功能基因仅占1/3～2/3，逐渐发现虚寒证的差异表达基因谱出现频率较多、较为集中于代谢类基因。一般与代谢相关基因可占已知功能基因的1/3～1/6，实验结果中最高出现53.1%。另外是与生长发育、免疫、细胞凋亡、细胞骨架和运动、原癌基因和抑癌基因、细胞信息、细胞受体、传递蛋白、DAN结合、遗传性疾病等相关基因。
       3.2 候选说明要强调说明的是两点，所谓已知功能的基因是有限的研究报导，实际上目前只是部分已知功能，而且多为少部分已知功能基因，因为人类刚进入后基因组时代，开始研究基因的功能;不少基因是多效应性的，而且基因的功能往往是相互起作用的，很少有单独作用的基因(有显性、上位性)，一个基因会涉及到多个方面的功能。中医的“症”，并不是“证”，若干症的有机组合才是证。在当前虚寒证证候-基因组的研究只能立足于有限、不全面的己知去研究未知，所以表1的代谢类相关基因是相对的、有限的，还要随着科技进步而发展的。
       4 结果：虚寒证证候-基因组的候选基因模块
       根据以上实验，目前虚寒证的差异表达基因谱之一出现较多地集中于代谢类的基因，对这一趋势本文初步得到虚寒证证候的第1批候选基因，与代谢相关的基因有35条(见表1)。筛选虚寒证第1批候选基因的主要原则是：在实验中重复出现的差异表达基因，以频率出现高的定性为主;差异表达基因上、下调的方向和比值作为参考。
       5 讨论：对代谢功能相关的基因分析示例
       阳气“若天与日”(《素问·生气通天论》)是生命活动的基本动力，为“真火”，是能量的源头。用基因芯片筛选虚寒证差异表基因的一个突出特点是：与代谢功能相关的基因大量出现，尤其是能量代谢类基因[6,7]。如上表中，滤泡细胞H+ATP 酶亚基(功能主要是运输ATP酶)等与能量代谢相关;艾杜糖醇脱氢酶糖醇还原酶(催化D-艾杜糖醇氧化成D-山梨醇，作用于葡萄糖醇而生成果糖)等与糖代谢有关;细胞外信号调节性激酶激活因子(丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶活性)等与蛋白质代谢有关;LPL脂蛋白脂肪酶1、磷酸二酯酶4B(催化寡核苷酸及多核苷酸中双重酯化的磷酸分子进行水解的酶类)与脂及酯类代谢相关[8];热休克90KDβ链蛋白1和DEAD/H框多肽5、雷诺啶受体3基因(与末梢循环障碍疾病相关)等与冷热的适应和调理功能密切相关。可见差异表达基因与能量、糖类、蛋白、脂类等，及其生理、病理等方面的代谢密切相关，以及冷热的适应和调理的功能基因相关，这些基因的高频率出现对虚寒证实质的深入研究，颇有方向性的提示意义。表1 虚寒证的第一批候选基因——与代谢相关的基因
       对虚寒证-基因组的研究是一项十分浩大的长期工程，面临着若干困难和挑战、若干断层与障碍，需要国家对其基础研究的大力支持，要多学科研究人员的合力攻关，需要把握证的合理内核才能有希望。本文虽然是在中医证候 “数”“质”“量”的基础较低的水平条件下的艰难起步，但也获得了虚寒证证候-基因组阶段性的成果，虽然候选基因只是极其有限的第一步探索，但已为今后扩大候选基因打下了基础，若能深入研究下去，必将有利于中医科技向人类基因组学、功能基因组学、生物信息学前沿穿插与赶超。
       【参考文献】
         　[1] 梁月华，谢竹藩.中医寒热本质的初步研究[J].中华医学杂志，1979，59(12):705.
       
       [2] 王米渠，杨 杰，高 锋，等.论寒证科学基础研究的六个时期及前瞻[J].辽宁中医杂志，2007，34(12):1694.
       
       [3] 严石林，李炜弘，王米渠，等. 分子流行病学在中医药研究中的应用前瞻[J].成都医药， 2002，28(2):70.
       
       [4] 严石林，李炜弘，王米渠，等. 寒证辨证因子等级量化操作标准的研究[J].中国中医药信息杂志， 2002， 9(8):64.
       
       [5] 王米渠，吴 斌，冯 韧，等.1个虚寒家系的调研报告[J].现代中西医结合杂志，2003，12(22):2385.
       
       [6] 王米渠，杨丽萍，丁维俊，等. 一个寒证家系中发现15个能量代谢差异表达的基因的报告[J].中医杂志，2006，47(2)：131.
       
       [7] Liping Yang ， Miqu Wang， Wei Wu ，et al. Transcriptome Analysis of Cold Syndrome Using Microarray[J]. The American Journal of Chinese Medicine， 2007， 35(4): 615.
       
       [8] 王米渠，冯 韧，严石林，等. 基因表达谱芯片与中医寒证的7类相关基因[J].中医杂志，2003，44(4):288.