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       【摘要】 
       目的探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员的骨髓基质干细胞(BMSCs)经皮注射对兔桡骨骨折愈合的促进作用。方法对56只白兔施行骨折模型，随机分为第1批(用药组A组、空白对照组B组)和第2批(纯化注射组C组、实验对照组D组)。骨折模型术后14，28 d取材进行影像学、组织学、组织形态计量学检测与分析。结果两个批次的实验组新生血管、骨小梁形成均明显优于同批对照组，4种骨痂记分、外骨痂厚度均高于对照组。结论通过rhG-CSF动员的BMSCs经皮注射后有明显的促进骨折愈合作用。
       【关键词】  重组人粒细胞集落刺激因子; 骨髓基质干细胞; 经皮移植; 兔; 骨折愈合
       骨折延迟愈合或不愈合一直是骨科临床十分关注的难题。由于自体骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs) 容易获取，而且具有较强的增殖能力，自体BMSCs应用于临床不需要胚胎组织和应用免疫抑制剂 [1]，因此许多学者研究提出自体骨髓经皮移植是一种经济适用微创的治疗方法。近年来随着分子生物学、组织工程学的迅猛发展，骨髓基质干细胞在不同的生长环境里可以向多种系的细胞分化，在此作者设想利用骨折断端局部的微环境，局部增加骨髓基质干细胞质量来加快骨折愈合的速度，促进肢体功能的早日恢复。期望对骨折愈合机制的研究以及骨折的临床治疗提供一种新的合乎生物学原则的思路。
       临床和实验研究均已证实粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)可以短期内快速动员机体外周造血干细胞增殖和趋化到外周组织损伤处，可以对血液和心肌方面的疾患起到较好的治疗作用。最近有研究报道G-CSF也可动员外周骨髓基质干细胞快速增殖[2]，本研究在新西兰大白兔骨折模型上皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)，运用自体骨髓基质干细胞体外纯化和经皮移植的手段，探讨其对骨折愈合的影响。现报道如下。
       1 材料与仪器
       1.1 动物健康成年长耳新西兰大白兔，56只，雌雄不拘，体质量3.2～4.1kg，4～6月龄，购自江苏省血吸虫病防治研究所实验动物中心。
       1.2 试剂与仪器rhG-CSF(山东齐鲁制药有限公司生产，商品名：瑞白，产品批号：20080832);淋巴细胞分离液(Cedarlane 公司)。离心机(北京京立 LDZ5-2);净化工作台;光学显微镜;手术包及骨髓穿刺包;吸管;离心管。
       2 方法
       2.1 动物骨折模型的制备[3]所有实验动物按体质量剂量经耳缘静脉注射异戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉，左前臂皮肤去毛，用碘酒、酒精常规消毒，局部作一切口，长约2 cm，剥离骨膜，于旋前圆肌止点远端用双锯片造成桡骨中段3 mm宽的骨缺损，缝合伤口，不作任何固定，术后用庆大霉素4U肌注3 d预防感染。
       2.2 实验分组与相关操作按随机化原则将56只大白兔随机分为2批。
       第1批两组(用药组A组、空白对照组B组)，每组14只，分笼喂养。模型制备成功1h后，A组家兔给予rhG-CSF 10μg/kg皮下注射，1次/d，每天同一时间给药，连续5 d;B组1次/d，连续5 d皮下注射相应体积的生理盐水。
       第2批两组(纯化注射组C组、实验对照组D组)，同样每组14只，分笼喂养。模型制备成功1h后，两组家兔均给予rhG-CSF 10μg/kg皮下注射，1次/d，每天同一时间给药，连续5 d。C组于第5天抽取骨髓，纯化后注射于骨折部位;D组在骨折处注射相应体积的生理盐水。
       2.3 BMSCs的分离与纯化[4]用异戊巴比妥钠(60 mg/kg)经耳缘静脉注射对C组大白兔进行麻醉，无菌操作下，16号骨髓穿刺针从髂后上棘处穿刺，接10 ml注射器，抽取骨髓4～5 ml，将其注入含肝素200 u/ml的0.01MPBS中，1 500 r/min离心10 min，弃去脂肪和上清，用PBS重悬制成细胞悬液，小心加入至2倍体积的淋巴细胞分离液上层，室温下以2 500 r/min离心25 min。用吸管吸取液面交界处云雾状液体，将其转移至1 ml注射器内。
       2.4 BMSCs的再植对C组大白兔，在原手术切口部位探查到骨缺损处，经皮注入分离纯化的BMSCs悬液，术后用庆大霉素4U肌注3 d预防感染。
       2.5 术后观察及标本收集观察切口局部反应及愈合情况;所有动物于造模手术后第14天、28天分2批用空气栓塞法处死，每组每批处死7只，动物处死后于肘腕部切断取样，先行X线摄片，随后去除骨折周围组织，以骨折处为中心锯下一段1 cm长的桡骨，置于10%甲醛固定3 d后，盐酸脱钙、石蜡包埋、切片，经HE染色。
       2.6 观察指标及统计学处理
       2.6.1 X线片观察观察骨折线、纤维连接、骨皮质连续情况、外骨痂及其厚度等。
       2.6.2 组织学观察及染色检查病理切片HE染色显示组织结构。
       2.6.3 组织形态学计量检查
       4种骨痂计分法：每个标本镜下所见4种骨痂(外骨痂、内骨痂、桥梁骨痂、联接骨痂)计分按：血肿1分，纤维(成纤维细胞)2分，软骨细胞和类骨质组织3分，小梁骨4分。计算所得分相加为总分，再进行统计学秩和检验处理。
       外骨痂厚度测量：用目镜测微尺计算每张切片中10个视野的外骨痂厚度求其平均数。再进行统计学t检验处理。
       2.7 统计学处理所有数据采用SPSS11.5软件包进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 X线片观察结果术后第14天：A组、D组骨折线模糊，断端已有少量纤维连接;C组骨皮质连续，骨折断端呈梭形,完全看不到骨折线;B组骨折线清晰可，见图1。
       A-用药组 B-空白对照组 C-骨髓纯化注射组 D-实验对照组
       图1 术后第14天各组骨折端影像学比较
       术后第28天：A组、C组、D组骨折已完全愈合，可见到明显的外骨痂，骨折局部密度增高，C组断端的塑形改造较其他各组明显提前;B组骨折断端有大量骨痂形成，断端连续，但髓腔未通，整体愈合情况不如A组。见图2。
       A-用药组 B-空白对照组 C-骨髓纯化注射组 D-实验对照组
       图2 术后第28天各组骨折端影像学比较
       3.2 组织学观察结果光学显微镜下显示术后第14天标本中骨折端可见大量成纤维细胞、成软骨细胞、成骨细胞，并有软骨形成，部分尚可见一些骨小梁出现。A组、D组外骨痂明显增厚，软骨成分及骨小梁量亦较多，有较多新生毛细血管出现;C组外骨痂明显增厚，可见大量软骨细胞生长，伴有大量新生毛细血管出现;B组见少量软骨细胞生成，骨小梁量较少，形成的毛细血管亦较少。见图3。
       A-用药组 B-空白对照组 C-骨髓纯化注射组 D-实验对照组
       图3 术后第14天各组骨折端光镜下形态学比较(HE 40×)
       术后第28天标本中，软骨、骨小梁大量形成。A组、D组的外骨痂、桥梁骨痂中的软骨细胞明显减少，代之以骨小梁为主的结构，骨小梁排列整齐;C组软骨内成骨完成，可见大量成骨细胞，骨小梁排列整齐，骨髓腔再通;而B组所见，骨折愈合进程明显减慢，其28 d标本相当于A组14 d标本。见图4。
       A-用药组 B-空白对照组 C-骨髓纯化注射组 D-实验对照组
       图4 术后第28天各组骨折端光镜下形态学比较(HE，40×)
       3.3 组织形态学计量结果
       3.3.1 4种骨痂计分结果采用秩和检验。第14天A组秩和为72.5，B组秩和为32.5，两组比较，P<0.05;C组秩和为74，D组秩和为31，两组比较，P<0.01。第28天A组秩和为71，B组秩和为34，两组比较，P<0.05;C组秩和为70，D秩和为35，两组比较，P<0.05。
       3.3.2 外骨痂厚度测量结果表1、表2显示术后第14天和第28天用药组的外骨痂厚度均高于对照组(P<0.01或P<0.05)。
       4 讨论
       G-CSF是传统的强有力的骨髓干细胞动员剂，可同时动员造血干细胞、间充质细胞[5]和内皮祖细胞[6]。可在较短时间内使外周血干细胞提高几十倍至几百倍[7]。徐新等[8]研究发现，应用G-CSF动员BMSCs，然后迁移到急性心肌梗塞的梗塞区域，可起到再生心肌组织，修复梗塞心肌的作用。王志伟等[9]研究表明，应用G-CSF使骨髓干细胞动员后，可促进缺血组织血管新生，增加缺血组织血液灌注，改善肢体缺血状态。刘岐焕等[10]研究结果显示，rhG-CSF具有促进骨髓源干细胞进入细胞周期增殖的作用，而且存在时间效应，骨髓源干细胞增殖的高峰在应用G-CSF 5 d后6 h左右，随后即下降。经皮注射自体骨髓干细胞治疗骨折临床已见报道。本研究设想rhG-CSF快速动员外周骨髓基质干细胞的数量扩增，有可能使其归究于骨折、组织损伤处，参与损伤组织和血管的再生及修复。同时在局麻下微创穿刺并在体外再次浓缩纯化后局麻下回植骨折处，期望起到促进骨折愈合的作用。
       因此，本实验在骨折动物模型皮下注射，在动员骨髓干细胞的高峰期骨髓穿刺抽取自体骨髓，体外迅速纯化后，自体回植骨折损伤处，局部增加骨髓干细胞的数量。本实验结果表明，rhG-CSF通过动员BMSCs结合纯化回植技术，具有刺激大白兔骨折局部新生毛细血管网的形成，改善骨折局部的血液循环，加快新陈代谢，尤其是强有力地刺激成骨细胞的活性，增加新骨的数量和质量等作用，从而有效地促进骨折愈合。
       本研究期望能在中医手法接骨外固定的基础上，探索一种新的快速促进骨折愈合的手段，并将进一步在骨折延迟愈合和不愈合的实验动物模型上作深入的研究。
       【参考文献】
         　[1] Lim SY,Kim YS,Ahn Y,et al.The effects of mesenchymal stem cells transduced with Akt in a porcine myocardial infarction model[J].Cardiovasc Res,2006,70(3):530.
       
       [2] 刘岐焕，程范军，陈 龙，等.粒细胞集落刺激因子对小鼠骨髓间充质干细胞的作用[J].武汉大学学报(医学版),2007,28(3):336.
       
       [3] 彭汉士，贝美莲，吴清和，等.中药肢伤三方促进骨折愈合的实验研究[J].广州中医药大学学报，2001，18(2):163.
       
       [4] Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenehymal stem cells[J].Science，1999，284(5411):143.
       
       [5] Kawada H,Fujita J,Kinjo K,et al.Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction[J].Blood,2004，104(12):3581.
       
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       [7] Kocher AA,Schuster MD,Szabolcs ML,et al.Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis,reduces remodeling and improves cardiac function[J].Nat Med，2001，7(4):430.
       
       [8] 徐 新，马绍椿，罗东云，等.应用G-CSF动员骨髓干细胞治疗急性心肌梗塞的研究[J].中国分子心脏病学杂志，2003，3(4):223.
       
       [9] 王志伟，马秀现，唐 哲，等.粒细胞集落刺激因子对家兔后肢缺血治疗作用观察[J]..郑州大学学报(医学版)，2007，42(2):334.
       
       [10] 刘岐焕，程范军，高清平，等.重组人粒细胞集落刺激因子促进骨髓间充质干细胞增殖[J].中华器官移植杂志，2006, 27(9):532.