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       【摘要】 
       目的探讨貂心脱氧核糖核酸(DNA)指纹特征鉴定方法。方法采用碱裂解法提取新鲜貂心与伪品动物组织中线粒体DNA，设计特异性引物，进行PCR扩增。结果从新鲜貂心及鸡心、鸭心、鹅心、兔心等伪品动物组织中提取出相同大小的16.8 Kb线粒体DNA，只有貂心DNA可扩增出1 100 bp大小的片段。结论貂心DNA具有特异性指纹特征，所得貂心DNA指纹特征图谱可用于与其伪品动物心脏的鉴定及分析，且方法简便，结果可靠。
       【关键词】  貂心; 线粒体DNA; 指纹特征; 鉴定
       貂心是名贵的药材, 是利心丸[1]中的主要成分。貂心在药品检验中尚无完善的检验方法，现有的检验方法只有企业内控标准的性状鉴别，无法对貂心的真伪作出准确的判断。
       DNA指纹图谱技术为中药材及其伪品的鉴别提供了一条新的途径[2,3]， 本文应用分子生物学技术，对貂心及其伪品进行了DNA指纹特征研究，采用碱裂解法提取新鲜貂心与伪品动物组织中线粒体DNA，设计特异性引物，进行PCR扩增。建立了貂心DNA指纹鉴定方法，确立了貂心DNA指纹特征图谱，为貂心与其伪品的鉴定提供了一种分子生物学检测手段。
       1 材料与仪器
       1.1 药材新鲜貂心、鸡心、鸭心、鹅心、兔心均由农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测实验站提供。
       1.2 试剂Buffer A：0.25 mol/L,0.03 mol/L Tris-HCl,1 mmol/L Na2EDTA，(pH 8.0);Buffer B：0.25 mol/L 蔗糖，0.05 mol/L Tris·HCl，7 mmol/L MgCl2, pH 8.0;Buffer C ：(0.05 mol/L Triso HCl，0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Na2EDTA，pH 8.5;Dnase I反应终止液：0.25 mol/L 蔗糖, 0.1 mol/L Na2EDTA,pH 8.0;购自北京鼎国生物技术有限责任公司。Taq DNA聚合酶：大连宝生物工程公司;琼脂糖：购置England。
       1.3 仪器紫外透射仪(ZF型)：中国上海;电泳仪、电泳槽(DYY-Ⅲ2)：北京六一仪器厂;Gene Amp R PCR System2700 Applied Biosystem：美国Perkin-Elmer公司;UV WHITE2020D凝胶成像分析系统：美国Cold spring 公司。
       2 方法
       2.1 线粒体DNA 的提取[4,5]①取新鲜的组织，用Buffer A洗净，剪碎，研磨，按1∶5的重量体积比稀释，4 000 r·min-1 4℃离心30 min，吸上清，除去核及细胞膜碎片。②上清液12 000 r·min-14℃离心30 min,弃上清，沉淀为线粒体。③用Buffer B洗涤1次，按0.5 ml·g-1组织的比例悬浮，加Dnase I使终浓度达100 μg·ml-1，30℃保温45 min,冰浴冷却，加入2倍体积的Dnase I反应终止液，12 000 r·min-1 4℃离心30 min,沉淀用Dnase I反应终止液洗涤一次，重复离心，得纯净的线粒体。线粒体用Buffer C悬浮(0.5 ml·g-1)，加入10%SDS至终浓度0.8%，37℃保温15min，冰浴冷却，加等体积的饱和酚轻微震荡至溶液呈乳白色，冰浴30 min。12 000 r·min-1 4℃离心10 min，取水相重复提取至界面无蛋白为止。④上层水相再用氯仿/异戊醇(24∶1)提取3次去酚，水相中加入0.2倍的1 mol/L NaAc,混匀，再加入2倍体积的预冷-20℃的无水乙醇，混匀置于低温冰箱中过夜。12 000 r·min-1 4℃离心30 min,真空干燥，溶解于TE缓冲液。⑤加入Rnase至终浓度为50 μg·ml-1，37℃保温1 h，然后用饱和酚、氯仿/异戊醇各抽提3次，水相中加入1 mol/L NaAc及无水乙醇沉淀mtDNA，用70%乙醇洗涤3次，干燥，以TE溶解，即得纯品。-20℃保存。
       2.2 紫外分光光度法的测定mt DNA将所获得的mt DNA样品经适当稀释，用紫外分光光度仪测定光吸收值A260、A280值，计算A260/A280比值。
       2.3 琼脂糖凝胶电泳制备0.7%琼脂糖凝胶(含EB 0.5 mg/L)，取5μl mt DNA样品并加入1 μl上样缓冲液混匀后点样, 60 V，90 min，成像并拍照。
       2.4 PCR检测应用Primer5.0引物设计软件设计貂心的特异性引物(由上海生物工程公司合成)。PCR反应体系：总体积为30 μl，循环条件，94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后于72℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳， 80 V，40 min，成像，拍照。
       3 结果
       3.1 mt DNA 的紫外光谱分析经多次重复试验，测得样品的A260/A280值在1.83±0.02之间，每克组织可获得(5.46±0.12)μg mt DNA。
       3.2 mtDNA的琼脂糖凝胶电泳分析采用碱变性的方法从新鲜貂心组织提取mt DNA可见一条相对分子质量为16.8Kb的单一条带，与对照组鸡心、鸭心、鹅心、兔心的mt DNA大小相同(见图1)。
       3.3 PCR产物用设计的引物对貂心、鸡心、鸭心、鹅心、兔心组织DNA进行扩增，只有貂心样品可扩增出1 100 bp的片段(见图2)。
       4 讨论
       貂心与其伪品(鸡心、鸭心、鹅心、兔心)的鉴别已成为利心丸质量标准控制的关键步骤。现代研究证明，貂心含有丰富的三磷腺苷、细胞色素C及心房肽，与其它动物心脏性状特点、理化性质等相同。在利心丸中，貂心脏是以干粉的形式与其它药(其它成分在药典里是保密的)配伍混合在一起的，由于貂心脏缺乏明显的形态鉴别特征和特殊的化学成分，因此传统的鉴定方法在貂心脏的鉴定中是十分困难的[5]。
       动物组织线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)，是一共价闭合的双链环状遗传物质，具有分子量小、结构简单、易于分离、无组织特异性等特点。其分子大小在14～42kb之间，绝大多数介于16～18kb。线粒体DNA(mtDNA)已被广泛应用于分类学、种系鉴定、遗传学、进化论等领域并取得一定的成就[6]。
       本课题采用分子生物学的方法，对貂心及其伪品的DNA进行了指纹特征研究，通过采用碱变性的方法提取貂心及其易混的动物组织心脏中的 mt DNA，采用引物设计软件设计出貂心的特异性引物并进行PCR特异性扩增，寻找出了貂心的最适退火温度，通过扩增出的1 100 bp 的貂心特异性条带，得到了貂心DNA的指纹特征图谱，该特征与其伪品鸡心、鸭心、鹅心、兔心的谱图有明显区别，实现了从分子水平上对貂心进行鉴定及分析，且方法简便，结果可靠。
       DNA指纹特征图谱的鉴定方法应用于中药材及其伪品的鉴定中[7]，是药检技术方面的有力而必要的补充，同时基于DNA分析技术的分子鉴定方法也可成为中药四大鉴定方法(基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定)的重要补充，从而也为中药鉴定技术开辟了一片新的领域[8,9]。
       【参考文献】
         　[1] 卫生部药品标准.中药成方制剂,第3卷[S].1993：80.
       
       [2] 王义权，徐珞珊，徐国钧，等.DNA分子遗传标记鉴别在生药鉴别中的应用前景[J].中国中药杂志，1997，22(10)：583.
       
       [3] 王夏炎.现代分析技术在中药指纹图谱研究中的应用[J].中草药，2004，7：附6.
       
       [4] Kocher TD, Thomas W.K, Meyer A, et al. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: Amplificaton and sequencing with conserved primers[J].Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1989,86(16):6196.
       
       [5] 张丽华，李明成，王冰梅.貂组织线粒体DNA及细胞色素b鉴定及特征[J].吉林大学学报(医学版)，2008,5：790.
       
       [6] 戴纪刚.一种简单快速制备动物线粒体DNA的方法[J].第三军医大学学报,2000,22(4):391.
       
       [7] 曹 玺，赵 远，王曙光.浅谈中药鉴定技术的进展[J].云南中医中药杂志,2004，25(5):36.
       
       [8] 邵鹏柱，曹 晖.中药分子鉴定[M].上海：复旦大学出版社, 2004:8.
       
       [9] 仇 萍，盛孝邦，罗杰英.DNA指纹图谱与测序技术在中药品质鉴定中的研究概述[J].中医药导报，2006，12(11)：77.