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       【摘要】 
       目的灯盏花两性小花中雄核发育呈现出高度的不同步化，给单核花粉时期的准确判定带来不便。而准确判定灯盏花单核花粉时期的小花形态，可为下一步进行灯盏花繁殖生物学及花药培育奠定基础。方法实验结合两性小花顶端的色泽、苞片的形态、小花的长度与小孢子发育过程的观察，对灯盏花小孢子发育及其花器形态学特征的相关性进行了研究。结果当灯盏花两性小花顶端色泽为嫩绿，苞片开放度为D，小花长度在0.1～0.17 cm时，单核花粉的比例可达50%左右。结论以小花顶端的色泽、苞片的形态、小花的长度为标准可有效判定灯盏花小孢子发育阶段。
       【关键词】  灯盏花； 小孢子发育； 花器形态
       The Relationship between the Stage of Androgenesis and Flower Character in Erigeron breviscapus
       ZHAO Weijing,YAN Shengqi,CUI Mingkun,ZHANG Yunfeng,GUAN Huilin
       （1.School of Biological Science，Yunnan Normal University,Kunming 650092, China；2.College of Environment and Energy, Yunnan Normal University， Kunming 650029, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship between  the stage of androgenesis and flower character of the stage of uninucleate pollen for further study in meiosis and anther culture in Erigeron breviscapus(Vant.) Hand-Mazz.MethodsThe relationship between the stage of androgenesis and flower character was determined by flower character investigation and development course of microspore in flowerlet. ResultsWhen the top color of flower was little green, the open degree was D, the flowerlet length reached 0.1～0.17cm, 50% cell in anther was uninucleate pollen, and the responsible anther could reach 65% in anther culture. ConclusionThe rule can be effective for determining the stage of main stage during androgensis in Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz. 
       Key words：Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz;  Androgenesis;  Flower character
        灯盏花又名灯盏细辛，为菊科飞蓬属短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz.植物，主要分布于云南、湖南、广西、四川、贵州和西藏等省区，其中95％以上的资源分布于云南［1］。2007年对云南灯盏花主要分布区的种质资源调查的结果表明除滇西北的资源分布还生长繁茂外，其余地区资源多处于枯竭状态［2］，结果与2002年的结论基本一致［3］。开展灯盏花野生变家种成为解决灯盏花资源短缺的重要手段。
       灯盏花栽培中一直缺乏优良的栽培品种，栽培种源大多是从野生资源中筛选出的有效成分含量较高的植株，通过组培快繁后，再以组培后代的小群体繁殖后代种子为栽培种源。花药、花粉培养作为快速获得纯合二倍体的技术手段，不仅可得到遗传背景丰富的育种资源，同时也可用于雄核发育及基因表达模式的研究［4，5］，目前在小麦、玉米、水稻、辣椒等作物上都取得了很大的进展［5］。作为菊科的灯盏花，两性小花中的雄核发育呈现出高度的不同步性，给单核花粉时期的准确定位带来极大的困难［6］。本实验结合两性小花顶端的色泽、苞片的形态及小花的长度与小孢子发育过程的观察，对灯盏花小孢子发育及其花器形态学特征的相关性研究，为下一步进行灯盏花花药培养奠定了基础。
       1  材料与方法
       灯盏花花蕾取自云南师范大学生命科学学院的实验园地，原始材料采集于云南丘北，实验编号为E28。取材时间为2009-04-20，随机取样。采集时将不同发育期的花朵放入卡诺固定液中固定24 h，经95%、80％的乙醇冲洗，然后保存于70％的乙醇中，置4℃条件下保存备用。制片时，花序在1 mol/L HCl中60℃水解15～20 min，取一枚两性小花，测量并记录长度，然后切取中上部，改良苯酚品红染色5～10 min后压片，在Motic光学显微镜下观察并于1 000×下照相。
       2  结果
       2.1  灯盏花的花器特征短葶飞蓬的头状花序单生于茎或分枝的顶端，直径2～3 cm。花序由外围的舌状花和中央的管状花构成，舌状花花数为90～220，管状花花数为130～350。舌状花舌片长1～1.3 cm，宽0.1 cm左右，近管部1/4处被稀疏毛，舌片基部连合成短管，管部长0.2～0.25 cm，被毛，仅具雌蕊，单性花，可结实。舌状花的柱头长，颜色呈紫红色、黄色或白色等，表现出丰富的多态现象。萼片特化为冠毛。管状花黄色，长0.35～0.4 cm，花冠管基部具环形蜜腺，两性花。聚药雄蕊由5枚雄蕊形成，花丝互相分离而花药边缘互相连合形成空筒形。结果与李鹂等［7］的观察一致。通过初期的实验观察，发现灯盏花的茎高及基部叶片数、茎叶片数等与小孢子发育进程都没有明显的相关性，对花序径长及其高度也同样如此。雌花与两性花的相对高度及两性小花径粗虽与小孢子发育有一定的关联，但不易观察测量，且有不少例外。经反复比较，确定以两性小花顶端颜色、苞片开度及小花长度三者作为相关的形态学指标。
       2.2  两性小花顶端颜色在小孢子发育过程中，孢母细胞依次经历了减数分裂期、四分体期、单核期、成熟花粉期（见图1），与此同时小花顶部的颜色依次按：白、白绿、嫩绿、绿、黄绿、黄发生变化（见图2）。随机取各种颜色的小花，对其雄性发育过程进行显微观察。结果见表1。表1  灯盏花中两性小花顶端色泽与雄核发育过程的相关性（略）
       从表1可以看出，小花顶端由绿开始，雄核发育成为成熟花粉粒的比例已很大，而白、白绿时开始减数分裂的小孢子母细胞还较少，所以减数分裂活跃期及单核花粉期均主要处在两性小花顶端颜色为嫩绿时。但嫩绿时包含的发育阶段过多，且对各期颜色的界定多具主观性，所以仅凭小花顶部颜色无法对小孢子发育阶段作出准确的判定。同时在灯盏花的减数分裂过程中没有发现异常的多价体、染色体桥及落后染色体，表明灯盏花的雄核发育是正常的。
       2.3  苞片开度在灯盏花的小孢子发育过程中，苞片逐步开放。经镜检发现，苞片开度与小孢子发育进程具有较好的相关性。同时还观察到，在每一个花序中，外层两性小花较中部、中部小花较内部发育早，但相差不多。如外层为刚形成的成熟花粉阶段时，中层常为单核期，而内层多在四分体期，在同层内发育程度则近似。同一枚小花的花药发育具有一定的同步性，即以某个发育期为主导，而未见到在一枚小花内有多个发育期且各期数目都均等的情况。据苞片的开度，我们将其分成若干类（见图3），对每类随机采30朵花，从每朵花的外层、中层及内层各取1枚两性小花显微观察，以确定苞片开度与小孢子发育的关系。
       由于本实验的主要的目的是判定减数分裂活跃期和单核花粉期，为此在表2中仅列出与二者所对应的苞片开度。由表2可知，苞片开度B、D分别是减数分裂活跃期和单核期的较好形态学标志，当开度小于B时小孢子母细胞大部分还未开始分裂，当开度大于D时则单核花粉逐渐向内层转移，随着开度的进一步增大，整个花序均将处于成熟花粉粒期。表2  苞片开放度与雄核发育的相关性（略）
       2.4  两性小花长度随着小孢子的发育，两性小花逐步变长，二者的相关性见表3。从表3中可以看出：两性小花长在0.05cm以下时，只观察到间期和分裂期，二者出现的比例分别是60%，40%。当小花长在0.05～0.10 cm时，以分裂期为主，为77.1%。小花长在0.10～0.15 cm时，四分体期最多占43.4%，但分裂期及单核期也不少。在0.15～0.2 cm范围内，成熟花粉最多占50%，而四分体及单核期也较多。0.2 cm及以上基本均在成熟花粉期。为此，如以观察灯盏花减数分裂各时期染色体变化为目的，可以0.05～0.1 cm的小花为材料；如以花药、花粉培养为目的，可以0.10～0.20 cm的小花为实验材料，此时单核花粉的比例为30%左右。进一步的实验表明，如选择在0.13～0.17 cm，单核花粉的比例可高达65％。表3  小花长度与各发育时期的相关性（略）
       
       3  结论
       从以上的讨论中，我们发现上述三类形态学指标虽均与小孢子发育进程相关，但每一类都有一些例外的情况，因而可以把三者综合起来，以得到更为准确的结果。由于苞片开度便于观察，也较准确，可以其为主。如寻找单核花粉时期的花药，可首先寻找苞片开度为D时的花序，然后看小花顶端颜色，如为黄色、黄绿及褐变的可排除，再看小花长度，内部在0.20 cm左右，外部在0.10 cm左右的也可排除。根据此方法，以小花顶端色泽为嫩绿，苞片开放度为D，小花长度在0.10～0.17㎝为标准选取，单核花粉的比例可达50％左右。以上工作为灯盏花繁殖生物学研究及花药培养奠定了基础。
       【参考文献】
         　　［1］中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第4册) ［M］. 北京:科学出版社，1975：444.
       
       ［2］王平理，杨生超，杨建文等.云南灯盏花种质资源的考察与采集［J］. 现代中药研究与实践， 2007，22(2): 25.
       
       ［3］俞宏渊，陈宗莲. 灯盏细辛的家化栽培［J］ .云南植物研究，2002，24(3)：115.
       
       ［4］Touraev A ，Pfosser M ，Heberle-Bors E. The microspore: a haploid multipurpose cell ［J］. Advances in Botanical Research，2001， 35，53.
       
       ［5］Thomas WTB，Forster BP，Gertsson B. 2003. Doubled haploids in breeding［M］. In: Maluszynski M，Kasha KJ， Forster BP，Szarejko I，eds. Doubled haploid production in crop plants. A manual. Dordrecht，The Netherlands: Kluwer Academic Publishers，337.
       
       ［6］Howell GJ， Slater AT，Knox RB. Secondary pollen presentation in angiosperms and its biological significance［J］.Australian Journal of Botany，1993， 41： 417.
       
       ［7］李 鹂，党承林. 短葶飞蓬(Erigeron breviscapus)的花部综合特征与繁育系统［J］.生态学报，2007， 27（2）:571.