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       【摘要】 
       目的研究毒热平注射液对流感病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1 表达IRAK4(IL-1 receptor associated kinase 4, IRAK4)的影响。方法用100 TCID50流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1后换用10 μg/ml浓度含药维持液继续培养，于12 h弃细胞上清液并收集细胞，提取细胞RNA和核蛋白，进行实时定量PCR反应（RT-PCR）和Western-blot实验，分别测定毒热平注射液对病毒感染前后巨噬细胞IRAK4 mRNA和NF-κB p65蛋白表达水平的影响。结果毒热平注射液可下调病毒感染巨噬细胞IRAK4 mRNA和NF-κB p65蛋白的表达水平。结论毒热平注射液的抗病毒作用可能与下调依赖MyD88的信号传导通路中IRAK4的表达有关。
       【关键词】  毒热平； 流感病毒； 巨噬细胞；IRAK4
       固有免疫是机体抵御病原生物侵袭的首道防线，有研究表明，机体针对病毒及其他病原生物等病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns ， PAMP) 的入侵所产生的固有免疫及适应性免疫由模式识别受体(pattern recognition receptors ，PRR) 启动［1］。其中，TLR7可识别病毒单链RNA，以MyD88依赖的信号通路活化免疫细胞，在介导抗病毒免疫应答中发挥重要的作用［2］。本实验观察毒热平注射液对流感病毒感染后该信号通路中IRAK4信号蛋白的影响。
       1  材料
       1.1  细胞狗肾细胞株（MDCK）购自军科院细胞室，由本室传代后使用；小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1购自南京凯基生物科技发展有限公司，由本室传代后使用。
       1.2  病毒流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)，中国中医药研究院中医所提供，本实验室-76℃保存备用。于九日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次后，测血凝滴度为1∶512。
       1.3  药物毒热平注射液（DRP），由黄芩、栀子、灯盏花和猪胆粉4味药物制成的中药复方注射剂，棕色液体，含生药17.4 mg/mL，由广东省康美药业有限公司开发提供。
       1.4  试剂Dulbecco"s Modified Eagle medium培养基（DMEM培养基）和RPMI-1640培养基，为GBICO公司产品；新生牛血清：民海生物公司产品。生长液：含10 %新生牛血清的1640培养液；维持液：不含血清而含2 μg/ml胰蛋白酶的1640培养液；引物及相关试剂由赛百盛生物公司合成提供；RT逆转录试剂盒购自Fermentas公司；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自美国应用生物公司。一抗：P65 (sc-372)，Santa cruz 产品；二抗（抗兔）（ZB-2301）购自北京中山生物技术有限公司。
       2  方法
       2.1  小鼠巨噬细胞株Ana-1的培养复苏小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1，将细胞混悬于生长液中，37 ℃ 5 % CO2 培养箱培养，次日换液，3 d 后传代1次，取生长状态良好的Ana-1细胞，消化液作用5 min 后，弃去消化液，加入适量生长液，吹打细胞，计数并调细胞浓度为3×106/ml，移入12孔板, 每孔加细胞悬液1 ml，贴壁培养4 h后弃去未贴壁的细胞。
       2.2  药物细胞毒性实验（MTT比色法）待Ana-1细胞生长状态最好时，用0.02%EDTA和0.5 %胰酶消化细胞，用生长液调整细胞至所需浓度，将该细胞液加入96孔细胞培养板中，100 μl/孔，于37 ℃、5 % CO2 培养箱中培养至致密细胞单层。用维持液将毒热平注射液稀释为不同浓度，加入细胞培养板中，100 μl/孔，每个药物稀释浓度平行做3个复孔，同时设正常细胞对照。于37 ℃、5 % CO2 培养箱中培养72 h后，用MTT（终浓度为0.5 mg/ml）比色法检测药物对Ana-1细胞的毒性，按Reed-Muench法计算药物最大无毒浓度（TC0）和半数中毒浓度（TC50）。
       2.3  病毒感染性测定（TCID50的测定）用无血清DMEM培养液对流感病毒FM1株行连续10倍递次稀释，将各稀释度的病毒接种于3×105 / ml的MDCK细胞中，每个稀释度平行做6个复孔，同时设正常细胞对照。37 ℃吸附2 h后吸弃病毒液换用维持液继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞病变效应，并记录病变程度和孔数，以细胞对照无明显退变，病毒感染细胞病变率达50 % 及以上的细胞孔为病变孔，细胞病变率小于50 % 的为非病变孔，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50（median tissue culture infective dosage）。流感病毒FM1的TCID50=10-4.3 。
       2.4  毒热平注射液作用于病毒感染的巨噬细胞用维持液稀释100 TCID50的流感病毒FM1株，0.5 ml/孔于37 ℃ 吸附单层Ana-1细胞1.5 h后，吸弃病毒液用温浴的PBS清洗细胞2次后，换用10 μg/ml的含药维持液作为实验药物组，同时设有正常细胞对照组和病毒对照组，每浓度3个复孔。37 ℃ 5 % CO2 培养箱培养，孵育12 h后，吸弃各孔细胞上清液，将12孔细胞培养板用封口膜封闭、标示后迅速放入-76℃ 保存。
       2.5  测定IRAK4和NF-κB p65的活性严格按试剂盒说明步骤提取巨噬细胞RNA和核蛋白。采用RT-PCR方法（引物序列见表1）测定IRAK4 mRNA的表达：PCR扩增条件为95℃ 3 min变性，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s；共40个循环，最后是72℃ 7min延伸。用 Western-blot方法测定NF-κB p65蛋白表达水平，β-actin 作为内参。结果见表1。表1  IRAK4的引物序列（略）
       2.6  统计学方法实验数据采用SPSS软件进行统计分析。结果以±s表示，采用t检验， P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
       3  结果
       3.1  测定药物对细胞的毒性 检测药物的最大无毒浓度（TC0）为1.09 g / L，半数毒性浓度（TC50）为2.73 g / L。
       3.2  IRAK4 mRNA扩增产物凝胶电泳分析行实时定量PCR反应前，首先要设计引物，因为引物序列合适与否对于实验有决定性的作用。反应完毕后对荧光定量PCR扩增产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下扫描分析结果。见图1。
       电泳结果表明，扩增的基因长度包括内参β-actin均符合设计长度，结果与荧光定量PCR一致，说明整个反应体系准确、可靠。
       3.3  毒热平注射液对IRAK4 mRNA表达的影响以样本cDNA稀释后求得的β-actin的扩增标准曲线斜率为-3.273，相关系数为-0.998，模板浓度对数值与Ct值之间呈良好的线性关系。根据标准曲线求出待测样本目的基因mRNA的相对拷贝数，与相对应的β-actin的相对拷贝数比较，求出其mRNA表达水平。结果如表2所示。表2  毒热平注射液对IRAK4表达的影响（略）
       结果表明，毒热平注射液能明显下调 IRAK4 mRNA表达的水平。
       3.4  毒热平注射液对NF-κB p65蛋白表达的影响在本实验中我们采用Western-blot的方法检测核因子NF-κB p65的表达，同时用细胞骨架蛋白β-actin为内参，检测样品的内参量和p65蛋白量。将各样品p65蛋白量分别除以其内参β-actin含量，即p65/actin 灰度值的变化，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白p65相对含量，再用此数值进行样品间p65的比较和分析，得到p65蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。见表3及图2。表3  毒热平注射液作用12 h 后的 p65/actin 灰度值的变化（略）
       毒热平注射液作用12 h 其p65/actin 灰度值的变化显示，病毒对照组与细胞对照组NF-κB p65蛋白表达量差异极显著，10 μg/ml组的毒热平注射液能明显下调流感病毒感染的巨噬细胞NF-κB p65蛋白的表达。
       4  讨论
       流感病毒常引起下呼吸道感染而致肺损伤，多属于中医的风温肺热病。近年来认为该类疾病气分热盛的同时伴有明显的血分证候，出现肺络受损的病理变化，即“毒损肺络”是其深层病机。毒热平注射液是由黄芩、栀子等4味药物制成的中药复方注射剂，具有清热解毒、凉血通络之功效。在前期的研究中我们证实毒热平注射液能抑制小鼠流感病毒性肺炎［3］，降低流感病毒感染小鼠的死亡率；通过调节细胞因子的活性，纠正Th1/Th2细胞失衡而发挥抗流感病毒作用［4］。在本研究中，我们探讨毒热平注射液经由依赖MyD88信号通路抗流感病毒的分子机制中IRAK4信号蛋白的作用。
       
       IRAKs 家族在TLRs/IL-1 信号通路中起着信号通路连接体和枢纽作用。IRAKs 家族包括IRAK-1、2、M和IRAK-4四个成员，其中IRAK4是TLR 介导的信号通路中的一个重要连接体，在炎症反应的启动和调节中有重要意义［5］。LTR7与流感病毒结合后促进本身的二聚体化以及与连接蛋白MyD88的结合，MyD88 通过其死亡域(death domain)与白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK4)结合，两者作用导致IRAK4的自身磷酸化，从而激活肿瘤坏死因子受体相关因子-6（IRAF-6），使有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族活化，最终活化NF-κB，控制炎症因子的分泌：如IL-6、IL-1、TNF-α和NO等。在本实验中，我们发现流感病毒感染的巨噬细胞内，通路中的信号蛋白IRAK4 mRNA和NF-κB蛋白的表达显著高于细胞对照组，说明病毒感染后IRAK4表达升高可活化NF-κB，使其活性增强。NF-κB的适度活化对于机体抵抗病原微生物的危害具有重要意义，NF-κB调节包括生长因子、转录因子、细胞素、趋化因子、抗凋亡蛋白等在内的基因转录：产生大量的前炎症因子、趋化因子以及α/β干扰素等，在病毒入侵机体的早期即可通过其介导的信号转导途径引起相关基因的表达，这些基因产物就可启动和调节固有免疫，并诱导适应性免疫的产生，在早期发挥抗病毒作用。但是，炎症因子和趋化因子的过度表达还会损伤组织，加重流感病毒所致的病理改变，如肺损伤，促进病情的进一步发展。毒热平注射液能适度下调IRAK4 mRNA的表达，从而引致NF-κB 蛋白表达降低，减轻炎症反应。我们的研究表明，IRAK4在TLR依赖的免疫应答中起关键作用，毒热平注射液可能通过降低IRAK4的表达发挥抗病毒作用。
       
       在TLRs/IL-1 信号通路中IRAK4的激酶活性对P38和JNK的活化有何影响还有待本实验室进一步研究观察。
       【参考文献】
         　［1］Sato S, St-Pierrec, Bhaumik P, et al. Galectins in innate immunity: dual functions of host soluble beta-galactoside-binding lectins as damage-associated molecular patterns (DAMPs) and as receptors for pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) ［J］. Immunol Rev, 2009, 230(1):172.
       
       ［2］Shohei Koyama,Ken J. Ishii,Himanshu Kumar, et al.. Differential role of TLR- and RLR-Signaling in the immune responses to influenza A virus infection and vaccination［J］. Immunology, 2007, 179: 4711.
       
       ［3］张艳丽，顾立刚，范新生，等.毒热平注射液抗甲型流感病毒的作用研究［J］.北京中医药大学学报,2007,30(10):684.
       
       ［4］张艳丽，顾立刚，范新生. 毒热平注射液抗流感病毒感染小鼠的保护作用［J］. 宁夏医学院学报,2008,30(2):150.
       
       ［5］Lye E, Dhanji S, Calzascia T, et,al. IRAK-4 kinase activity is required for IRAK-4-dependent innate and adaptive immune responses［J］. Eur Immunol,2008,38(3):870.