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       【摘要】 
       目的研究断血流皂苷A在大鼠体内的药动学。方法建立柱切换高效液相色谱法测定血浆中断血流皂苷A浓度的方法。色谱条件：预处理柱(PC)：大连装Kromasil C18（20 mm×4 mm，5 μm）；预处理流动相：甲醇-水；预处理流动相流速：1.0 ml·min-1；分析柱(AC)：Lichrospher 100 RP-18e(250 mm×4 mm，5 μm)；分析流动相：甲醇-0.01 mol·ml-1磷酸盐缓冲液(磷酸调pH =3.0)（60∶40）；分析流动相流速：0.6 ml·min-1；分析柱柱温：45℃；检测波长：250 nm。健康大鼠禁食24 h后，尾静脉注射断血流皂苷A溶液，测定不同时间的血药浓度。用3P87药动学程序对血药浓度一时间数据进行拟合。结果大鼠在尾静脉注射断血流皂苷A后，其主要药动学参数为：Vt(0.31±0.05)L·kg-1，CL(1.13±0.32)ml·min-1，Ke(0.90±0.18)h-1，t1/2(0.76±0.11)h，曲线下面积AUC(24.98±4.82)( μg·h) ·ml-1。结论断血流皂苷A在大鼠体内呈一室开放模型，进入体内迅速分布，代谢消除也较快。
       【关键词】  断血流皂苷A； 柱切换高效液相色谱法； 药动学
       断血流皂苷A(clinopodiside A)系从断血流中提取的主要成分, 属于齐墩果烷型三萜皂苷类，含量较高，且化学性质稳定，断血流为20世纪70年代从民间验方筛选，经临床验证后被国家药典录入的少数几个单味药之一，其疗效确切，安全性高，被公认为中医临床首选口服妇科止血药。临床上断血流制剂被广泛用于治疗各种出血、单纯性紫癜、原发性血小板减少性紫癜等症［1］。近年来，有关断血流的研究主要集中于有效成分的提取、鉴别、药理、药效及临床应用。而断血流药动学研究未见报道。为此，本文参照相关文献［2～8］，建立了柱切换高效液相色谱法测定血浆中断血流皂苷A浓度的方法，对大鼠静注断血流皂苷A后的药动学进行了研究，为其新剂型的研究和临床合理用药提供依据。
       1  仪器、试药与动物
       
       　　Agilent公司1100系列高效液相色谱仪(包括DAD检测器)；FCV-2A高压切换阀；高速离心机(上海安宁科学仪器司)；BSZ-2型自动双重水蒸馏系统(上海博通)；SartoriusBP221S型电子天平(美国Sartorius公司)；TG328B型析天平(万分之一天平)(上海天平仪器厂)。
       
       断血流皂苷A对照品（中国药品生物制品检定所），甲醇为色谱纯，水为三重蒸馏水（自制），其余试剂为分析纯。
       
       健康SD雄性大鼠(江西中医学院动物中心)，雄性，体质量(199.7±4.3) g，实验前大鼠禁食12 h，可自由饮水。
       2  方法
       2.1  色谱条件预处理柱(简称PC)：大连装Kromasil C18（20 mm×4 mm，5 μm）；预处理流动相(简称PMP)：甲醇-水；预处理流动相流速：1.0 ml·min-1；分析柱(简称AC)：Lichrospher 100 RP-18e(250 mm×4 mm，5 μm)；分析流动相（简称AMP）：甲醇-0.01 mol·ml-1磷酸盐缓冲液(磷酸调pH =3.0)（60∶40）；分析流动相流速：0.6 ml·min-1；分析柱柱温：45℃；检测波长：250 nm。
       2.2  对照品溶液的配制精密称取干燥至恒重的断血流皂苷A对照品7.5 mg，置25 ml量瓶中，用分析流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得含断血流皂苷A为0.3 mg·ml-1的对照品溶液。
       2.3  样品处理步骤取大鼠血浆样品1.0 ml，置2 ml具塞离心试管中，加0.3 mol·L-1的三氯乙酸0.2 ml，离心(4 000 r·min-1，10 min)，精密量取上清液置于试管中，氮气吹干，残渣用15%甲醇溶液转入1 ml量瓶中，加15%甲醇至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
       2.4  柱切换系统及操作本实验应用自装定时装置，控制切换阀自动切换。该装置可预置T1(样品预处理时间)和T2(AC与PC串联时间)。样品进样的同时启动该装置，首先使切换阀处于PC与AC并联的A(预处理)状态，经T1(2 min)时间的预处理后切换阀自动切换至PC与AC串联的B状态，使保留在PC上的样品组分被AMP洗脱至AC上，经T2(2 min)时间后，即自动切回初始A状态；待下次进样时再次启动该装置重复操作。
       2.5  专属性实验取空白大鼠血浆按样品处理步骤方法操作，其色谱图见图1(A)；空白大鼠血浆加断血流皂苷A对照品的色谱图见图1(B)；大鼠静脉注射给药断血流皂苷A后的血浆色谱图见图1(C)。由图1可知，在本色谱条件下，断血流皂苷A能够检测到，并且与血浆中的内源性物质分离良好。断血流皂苷A的保留时间约为7 min。
       2.6  标准曲线  取空白大鼠血清1 ml，加入上述对照品溶液0.5，0.7，0.9，1.1，1.3，1.5 ml，置于10 ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，得到浓度为0.015，0.021，0.027，0.033，0.039，0.045 mg·ml-1的系列对照品溶液。按照“2.3”项下样品处理步骤制备成对照品溶液，在拟定色谱条件下精密吸取10 μl注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(X，μg)对峰面积进行线性回归，得方程为：Y=0.311 3X-0.044 1（r=0.999 5）结果表明断血流皂苷A在15～45 μg·ml-1范围内具有良好的线性关系。
       2.7  日内和日间精密度  取一定量（高、中、低3种浓度）断血流皂苷A对照品大鼠血浆液，按“2.3”项下样品处理步骤处理，采用断血流皂苷A血浆柱切换高效液相色谱法测定，在1天内连续测定6次，得日内精密度分别为1.22％，0.81％和0.39％(n=6)；连续3 d测定，测得各浓度的日间精密度RSD分别为：1.67％、0.74％和0.45％(n=6)。
       2.8  重复性实验取断血流皂苷A对照品大鼠血浆液，按“2.3”项下样品处理步骤处理制备6份对照品溶液，采用断血流皂苷A血浆柱切换高效液相色谱法测定，得RSD为2.1％（n=6），表明本方法重复性良好。
       2.9  样品稳定性实验取一定量（高、中、低3种浓度）断血流皂苷A对照品大鼠血浆样品，分别进行样品处理液稳定性实验：进样条件下样品处理液在5℃放置0，4，10，20，40 h进样分析；样品冷冻放置稳定性试验：－20℃冷冻储藏，分别放置0，6，20，40 d后按“2.3”项下样品处理步骤处理进样分析；室温放置稳定性试验：室温放置0，1，2，4 h后按“2.3”项下样品处理步骤处理进样分析。所用测定结果准确度均在89%～112%范围内，RSD均＜5％，断血流皂苷A在上述条件下均稳定性良好。
       2.10  净化回收率取一定量（高、中、低3种浓度）断血流皂苷A对照品血浆液，按前述色谱条件测定含量5次，另取相同进样量断血流皂苷A对照品溶液，直接进样测定。按峰面积计算，得血浆净化回收率。结果见表1。表1  净化回收率（略）
       2.11  方法回收率于空白大鼠血浆中加入一定量（高、中、低3种浓度）断血流皂苷A对照溶液，按“2.3”项下样品处理步骤处理，按前述色谱条件测定含量5次，求出回收量浓度（即实测值）与加入量浓度之比，即为断血流皂苷A血浆空白加样回收率。结果见表2。表2  方法回收率（略）
       2.12  药动学研究方法随机取大鼠6只。按10 mg·kg-1尾静脉注射断血流皂苷A，给药后5，10，20，50，90，150，240 min时分别从眼眶取血，肝素抗凝，按“2.3”步骤分离血浆，并于-20℃保存。   
       采用柱切换高效液相色谱法测定断血流皂苷A的血药浓度，大鼠iv给药后的平均药物浓度一时间曲线见图2。将不同时间断血流皂苷A的血药浓度用3P87软件处理，表明大鼠在尾静脉注射断血流皂苷A后，其血药浓度随时间变化符合一室开放模型，主要药动学参数为：Vt(0.31±0.05)L·kg-1，CL(1.13±0.32) ml·min-1，Ke(0.90±0.18)h-1，t1/2(0.76±0.11)h,曲线下面积AUC(24.98±4.82)( μg·h) ·ml-1。
       3  讨论
          
       本实验首次建立了生物样品中断血流皂苷A的HPLC测定法，断血流皂苷A与血及各组织中的其他成分完全分离，测定结果不易被干扰，方法回收率较高，精密度良好。本法操作简便、成本低廉，适用于断血流皂苷A的药动学研究。
       
       断血流皂苷A在大鼠体内呈一室开放模型，进入体内迅速分布，代谢消除也比较快，其生物半衰期为46 min。
       【参考文献】
         　［1］Lee JH，Kim JM，Kim C．Pharmacokinetic analysis of rhein in rheum undulatum L［J］.J Ethnopharmacol，2003，84(1)：5.
       
       ［2］潘丽怡，车庆明，何红.灯盏花乙素的药动学研究［J］.中国药学杂志，2006，41(9)：689.
       
       ［3］葛庆华，周臻.灯盏花素在犬体内的药动学和绝对生物利用度研究［J］.中国医药工业杂志，2003，34(12)：618.
       
       ［4］庞志功，汪宝琪，李海峰. 紫草素复方的药动学研究［J］.西安医科大学学报，2001，22(4)：319.
       
       ［5］项琪，程刚，陈济民.芍药甘草汤在大鼠体内药动学研究［J］.中国药学杂志，2000，35(9)：615.
       
       ［6］邹节明，孟杰，颜正化，等．中药复方有效成分淫羊藿苷的药动学研究［J］.中草药，2002，33(1)：55.
       
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       ［8］Pei WJ，Zhao XF，Zhu ZM，et al．Study of the determinati0n and pharmacokinetics of compound Danshen Dripping pills in human plasma by column switching liquid chromatography electrospray inn trap mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2004．809：237.