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       【摘要】 
       目的观察姜黄素对子宫内膜异位症（EMs）内膜细胞雌激素生成水平的影响。方法首先建立子宫内膜异位症体外模型，分离培养EMs腺上皮细胞和间质细胞，随后将分离培养的细胞与混合培养细胞的雌激素分泌水平进行比较，明确EMs内膜高水平雌激素的组织来源，再次混合培养EMs的异位内膜细胞，加入终浓度为50 μg/ml的姜黄素，进行药物干预。分为非EMs内膜细胞组、EMs内膜细胞组、姜黄素组及来曲唑组，电化学发光免疫法检测培养液上清中雌二醇（E2）水平。结果电化学发光免疫法表明，EMs内膜细胞组雌二醇分泌水平最高，为(16.82±1.04) pg/ml，明显高于其余各组，组间比较差异有极显著性。EMs内膜细胞分泌雌二醇的水平随着时间的延长而增加。姜黄素50 μg/ml组和0.1 μg/ml来曲唑组较未给药的EMs内膜细胞组分泌雌二醇的水平明显降低。结论EMs内膜细胞分泌雌激素呈高表达，并且间质细胞和腺上皮细胞均有较强的分泌能力，与非EMs内膜细胞相比，差异显著。姜黄素可抑制EMs体外雌激素分泌的能力，并呈时间依赖性。
       【关键词】  子宫内膜异位症；姜黄素；雌激素
       子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是生育期妇女常见的良性疾病，不孕率呈逐年上升趋势，其发病机制尚未阐明。在经血逆流“种植学”的基础上，研究学者提出的“在位内膜学说”表明，EMs的在位和异位内膜相似的具有与正常子宫内膜迥异的遗传和内在生物学特性。因此可以推测，EMs在位内膜是病变的源头，而直接干预在位内膜可达到防治EMs的效果。EMs是雌激素依赖性疾病，雌激素的合成和代谢与EMs的发生发展密切相关。抑制EMs病灶局部雌激素生成成为目前研究关注的热点。
       
       姜黄素（Curcumin）是从姜黄、郁金的块茎中提取的一种植物多酚，具有抗炎、抗肿瘤、诱导凋亡等作用。近年研究表明它在体内外均可诱导EMs内膜细胞凋亡。本实验以EMs异位细胞体外模型作为实验对象，以“雌激素依赖性疾病”为切入点，观察姜黄素对其雌激素生成是否具有抑制作用，探讨姜黄素源头治疗EMs的作用靶点和机制，为EMs的治疗开辟新的途径。
       1   材料
       1.1  试剂的配制
       1.1.1  DMEM液称量DMEM粉剂6.75 g放入烧杯中，用少量的三蒸水混匀，再用三蒸水定容至400 ml，用增压滤器高压除菌，装入消毒瓶中备用，4℃保存，用前加入10%含量的胎牛血清。
       1.1.2  4%台盼蓝母液称取4g台盼蓝置于研钵中，加入少量的三蒸水反复研磨，再加入三蒸水至100 ml，以1 500 r/min离心15 min，收取上清液即为4%水溶液，使用时用PBS稀释至0.4%。
       1.1.3  0.1%胰酶称量PBS粉剂0.955 g，胰酶0.1g，EDTA0.01 g，将其放入100 ml三蒸水中混匀，用增压滤器高压灭菌，放入消毒瓶中备用。
       1.1.4  0.02%EDTA称取186.1 g Na2EDTA·2H2O，置于1 L烧杯中，加入约800 ml的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约20 g NaOH)，加去离子水将溶液定容至1 L，适量分成小份后，高温高压灭菌，室温保存。
       1.1.5  0.1 mol/L PBSNaCl 8 g,Na2HPO4·12H2O 2.89 g,KH2PO4 0.2 g,KCl 0.2 g充分溶解于900 ml的3蒸水中，调pH值为7.2～……7.4，定容至1 000 ml，放置4℃的冰箱中备用。
       1.2  病例的选择及子宫内膜标本的采集
       1.2.1  EMs的病例入选标准2008-06～2009-06在湖北郧阳市人民医院妇产科因子宫内膜异位症就诊的患者9例，年龄24～45岁，月经规律，周期28～32 d，无其他内分泌、免疫或代谢性疾病，手术前三个月内未接受激素治疗，腹腔镜下切除巧克力囊肿，用无菌手术刀切下标本部分，装入已经准备好无血清加入双抗的DMEM液的无菌管内，立即送回实验室。
       1.2.2   对照组病例入选标本标准2008-06～2009-06在本生殖中心因不孕来行IVF-ET的患者，行宫腔镜时留取子宫内膜。装入已经准备好的无血清加入双抗的DMEM液无菌管内，立即送回实验室。
       1.3  受试药物与剂量姜黄素，购自于Fluka公司，分子式C12H20O6，分子量为368.4，纯度为99%。本课题组前期的研究表明，姜黄素的剂量为50 μg/ml时能发挥最佳的药理性能，故本实验将采用此剂量来观察对EMs的雌激素分泌的影响。以0.1mg/kg来曲唑作为西药对照组。
       2  方法
       2.1　细胞原代培养
       
       在实验室的超净台中，用PBS洗涤标本4次，剔除血块，并在第4次洗涤时加入双抗20 μl，用无菌镊子将标本放置于无菌组织瓶中，用组织剪将标本剪碎至＜1mm3（肉眼呈模糊状），目测标本体积。
       
       加入1 ml胎牛血清，保持标本的湿润。
       
       取出小号组织皿，将血清以点状滴入小号组织皿中，轻轻的晃动，使血清均匀的铺满皿底。
       
       用无菌吸管吸取组织，分别置于小号组织皿中，将组织均匀的铺满皿底，用无菌吸管弃去多余的血清，用记号笔标记组织皿。
       
       将小号组织皿置于37℃含5%CO2培养箱中孵育4 h，倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，可见间质细胞已经贴壁生长，未见腺上皮细胞贴壁。
       用含20%胎牛血清的DMEM液缓慢的滴入小号组织皿中，每皿加入2 ml。再次放入37℃含5%CO2的培养箱中培养，倒置显微镜下观察，EMs组和非EMs组内膜形态相似。24 h后间质细胞已经完全贴壁，形态较扁平，呈梭形或纺锤形，外形轮廓不太清晰，核不明显，培养3～……4 d后细胞与细胞之间呈平行排列；腺上皮细胞培养24 h后可见大部分贴壁，呈蝌蚪形或多角形，漩涡状成团排列，并逐渐向外生长，核仁较大而明显，细胞间出现丝状连接。每2～3 d更换1次培养液，镜下观察细胞生长情况。
       2.2  细胞传代培养
       
       用倒置显微镜观察，当细胞铺满90%培养皿时即可传代。
       
       用无菌吸管弃去组织皿中的培养液，加入已预温好的PBS液2 ml进行洗涤，用无菌吸管弃去洗涤液。
       
       加入含0.02%EDTA的胰酶2 ml，放入培养箱中消化4～6 min，期间取出镜下观察细胞消化情况，细胞呈现椭圆形，细胞与细胞间的连接中断，此时，表明消化已完全。
       加入含10%胎牛血清的DMEM液终止消化。并用巴氏管将细胞从皿底吹打下。
       
       用无菌吸管将细胞及培养基一并取出置于离心管内，配平，放入离心机内，900 r/min，离心5 min。
       
       弃去上清液，再次加入含10%胎牛血清的DMEM液5ml重悬，充分吹打，使细胞均匀的分布于培养液中。
       
       将离心管内的细胞悬液分装置2个中号组织皿中，镜下观察细胞密度。以密度60%为佳。密度过高或过低均不利于细胞的生长。
       2.3  细胞观察与鉴定
       2.3.1  活细胞观察每天用倒置显微镜直接观察贴壁的活细胞生长情况。
       2.3.2  细胞免疫荧光鉴定将原代培养的EMs细胞消化并计数，按照1×104/ml将其接种于24孔培养板中，培养板上放置一张1cm×1cm的小盖玻片。待24～48 h细胞贴壁后，将爬满间质、腺上皮的混合培养细胞的小玻片用预温后的PBS冲洗3次，晾干。加入95%乙醇固定20 min。再次PBS冲洗3次，5 min/次。用10%羊血清加入0.3%Triton，穿透10 min。三蒸水冲洗，PBS浸泡5 min。正常羊血清工作液封闭，室温30 min，弃去血清，滴加鼠抗人波形蛋白、鼠抗人角蛋白工作液作为I抗，用PBS替代I抗作为阴性对照，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5 min。滴加FITC标记的II抗，避光，常温下孵育2 h。PBS冲洗3次，5 min/次。缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察，结果腺上皮细胞团角蛋白染色阳性，波形蛋白阴性；间质细胞波形蛋白染色阳性，而角蛋白阴性。
       2.4   电化学发光免疫法定量分析内膜细胞分泌雌二醇水平的差异将原代培养的EMs和非EMs内膜细胞，以6×105/ml的密度接种于96孔板中，培养4 h后半量加液，24 h后更换培养液，弃除红细胞等杂质后，更换不含血清的DMEM培养液使其同步化。24 h后重新更换为含20%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。共分为3组，EMs组，非EMs组，空白对照组（即不加细胞的培养液）。48 h后收集各组培养液分装于EP管中，1 500 r/min离心10 min取上清，-70℃冻存，以电化学发光免疫荧光法测定上清中雌二醇浓度。
       2.5  电化学发光免疫荧光法定量分析姜黄素对EMs内膜细胞分泌雌二醇水平的影响细胞培养和同步化处理方法同“2.4”项，在96孔细胞培养板中，将第2代贴壁的EMs内膜细胞分为细胞对照组，空白对照组，姜黄素组(50 μg/ml）、及来曲唑组，各组同时加入雄烯二酮1×10-7/ml进行刺激，各组均设计0，24，48，72，96 h 5个时间检测点，各个时间检测点设置3个重复孔，按时间顺序收集每组培养液，1 500 r/min离心10 min取上清，-70℃冻存，以电化学发光免疫荧光法测定上清中雌二醇的浓度。
       2.6  统计学分析 计数资料分析以±s表示，评价多组数据的差异采用单因素方差分析，以上数据资料均由统计软件包SPSS11.5完成。以P＜0.05表示差异有显著意义，P＜0.01表示差异有极显著统计学意义。
       3  结果
       3.1  细胞培养成功率混合培养的非EMs内膜细胞12例，成功10例，成功率为83.3%，EMs内膜9例，成功建立体外模型7例，成功率为77%。其中1例为污染，另一例为生长停滞。
       3.2  内膜细胞分泌雌二醇水平的检测结果电化学发光免疫法结果表明，EMs内膜细胞组雌二醇分泌水平最高，为（16.82±1.04）pg/ml，明显高于其余各组，组间比较差异有极显著性。结果见表1。表1  子宫内膜细胞分泌雌二醇水平（略）
       3.3  姜黄素对EMs内膜细胞分泌雌二醇水平的影响电化学发光免疫法结果显示，EMs内膜细胞分泌雌二醇的水平随着时间的延长而增加，24，48，72 h和96 h雌二醇的水平分别较前一时间点增长33.18%，57.28%，38.80%和12.45%。姜黄素50 μg/ml组和0.1 μg/ml来曲唑组较未给药的EMs内膜细胞组，分泌雌二醇的水平明显降低，在药物作用的48，72和96 h差异显著。结果见表2。表2  姜黄素对EMs内膜细胞分泌雌二醇的影响（略）
       
       4  讨论
           　
       子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病，其发生发展与雌激素有着密切的联系［1］。EMs的病因不明，黏附-侵袭-血管生成是在位内膜细胞异位种植发生病变的基本病理过程。在这一过程中，局部雌激素增高是异位内膜细胞成功种植的关键因素，有些学者研究认为雌激素的作用主要涉及两个方面［2］：一方面是子宫内膜可持续性的变化，包括内膜细胞雌激素受体含量的改变或组织中雌激素合成酶活性及种类的变化，另一方面是腹腔环境和自身免疫因素的改变，导致经血逆流的内膜易于黏附和侵入病灶处而导致EMs的发生发展。卵巢是雌激素合成的最重要的部位，其利用血液中的胆固醇经过若干酶的催化作用合成雄烯二酮和睾酮，并在芳香化酶的作用下转化成雌酮，再经过17β-羟类固醇脱氢酶作用下转化为雌二醇，发挥其雌激素的作用，调节雌激素的含量。研究表明［3］，雌激素含量除受内分泌、旁分泌调节外，还有自分泌调节。雌激素可以由异位内膜经P450arom催化合成，通过EMs的在位和异位内膜细胞中存在着雌激素的细胞内分泌和旁分泌机制直接与同一细胞内或临近细胞中的雌激素受体结合而发挥作用。国外已有研究表明EMs患者的在位和异位子宫内膜局部都有P450A表达。近年研究显示［4］，雌激素可通过启动Wnt信号通路参与EMs的病变过程。在一些雌激素依赖性肿瘤如乳腺癌和子宫内膜癌中雌激素通过介导Wnt信号通路参与了肿瘤的侵袭、转移和血管生成［5］。Noble等［6］也发现在正常的内膜组织和平滑肌中则没有P450arom的表达，进一步证明EMs的雌激素依赖性。但正常子宫内膜是否有P450A表达还存在争议。
       
       在位内膜决定论的提出对种植学进行了重要的修正［7］，经血逆流仅是一生理现象，是EMs发生的一个诱因。EMs患者自身在位内膜发生分子学异常,如具有合成雌激素的能力才可能是EMs发生的始动因素，此时的在位内膜随逆流经血进入腹腔则易于种植生长，从而加速EMs的病理进程。本实验根据Samposon的经血逆流致病学说建立EMs的体外模型，用异位的子宫内膜进行体外培养，使之种植在培养瓶上生长，可一定程度上模仿逆流内膜在子宫以外的其他地方的种植，并体现其内在的生物学特性。本实验通过原代EMs内膜细胞培养，获得混合细胞培养上清液，并通过电化学发光免疫分析，EMs内膜细胞中分泌雌二醇的水平远高于非EMs对照组。这也说明EMs患者的内膜已经存在与非EMs内膜迥然不同的内在生物学特性。因此，当“经血逆流”等客观条件存在时，就可发生、发展为EMs，这一结果也为“在位内膜决定论”提供了一新的实验依据。实验表明，在进行同一数量级细胞的比较时，无论是腺上皮细胞还是间质细胞，均参与EMs局部雌激素高浓度的形成，混合培养有利于研究内膜细胞的旁分泌和自分泌作用，以及细胞间生物信息的互相干预，而单一细胞培养，由于缺乏细胞因子的支持作用，细胞难以传代，生长数目也十分有限。因此我们在探讨姜黄素对EMs雌激素生成的作用时均采用了混合细胞培养模型作为研究对象。同时我们也发现，中药有效成分姜黄素在终浓度为50 μg/ml时，分别作用48，72和96 h后可明显降低EMs内膜细胞分泌雌二醇的水平，与同时间点EMs内膜细胞对照组比较，差异显著（P＜0.01）。姜黄素干预后的EMs异位细胞雌激素的分泌水平呈低分泌，由此可见，姜黄素可抑制EMs内膜细胞体外雌激素分泌的能力。提示姜黄素对EMs的治疗具有潜在的应用前景。
       
       总之，本实验成功的建立了子宫内膜异位症的体外模型，并通过姜黄素的干预达到抑制EMs细胞雌激素生成的目的，这使我们有理由做出设想，姜黄素是否通过作用于雌二醇合成过程中的关键酶和因子，从而降低EMs局部病灶雌二醇的生成而抑制EMs的发生发展呢？但目前的实验研究仅限于细胞模型，并且雌激素分泌异常并不是子宫内膜异位灶发生的唯一分子学机制，异位内膜的种植和生长必须完成黏附、侵袭和血管生成等一系列复杂过程。而姜黄素的成分种类繁多，发挥作用的成分和作用机制尚未系统、明确地探讨，因此姜黄素对雌激素生成及灭活过程中关键酶及因子的调节是否为其治疗EMs的核心分子学基础，姜黄素是否通过此机制阻止异位病灶进一步发生发展的进程，有待深入研究。
       【参考文献】
         　［1］Velasco I,Rueda J,Acien P.Aromatase expression in endometriotic tissues and cell cultures of patients with endometriosis［J］.Mol Hum Reprod,2006,12(6):377.
       
       ［2］Acconcia F,Kumar R.Signaling regulation of genomic and nongenomic functions of estrogen receptors［J］. Cancer Let,2006,238(1):1.
       
       ［3］Bulun SE, Lin Z, Imir G,et al.Regulation of aromatase expression in estrogen-responsive breast and uterine disease:from bench to treatment［J］..Pharmacol Rev,2005,57(3):359.
       
       ［4］Mulholland DJ,Dedhar S,Coetzee GA,et al. Interaction of nuclear receptors with the Wnt/beta-catenin/Tcf signaling axis: Wnt you like to know［J］.Endocr Rev,2005,26(7):898.
       
       ［5］Wagner J,Lenhmann L.Estrogens modulate the gene expression of Wnt-7a in cultured endometrial adenocarcinoma cells［J］.Mol Nutr Food Res,2006,50(4-5):368.
       
       ［6］Noble LS. Takayama K, Zaitoun KM,et al.Prostaglandin E2 stimulates aromatase expression in endometriosis derived stromal cells［J］.Clin Endocrinol Metab.1997 Feb;82(2):600.
       
       ［7］郎景和.子宫内膜异位症研究的新里程［J］.中华妇产科学杂志,2005,40(1)：3.