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       【摘要】 
       目的研究壳聚糖对参芪水煎液成分纯化的影响。方法以总多糖含量、固含物的量为指标，采用正交设计法进行研究，并结合HPLC指纹图谱法进行分析。结果壳聚糖用量对参芪水煎液中多糖具有显著影响，由正交法可知最佳纯化条件为A3B1C2D3，该工艺总多糖含量为49.26%，固含物的量为55.58%。HPLC指纹分析可知不同工艺纯化液的指纹图谱全貌具有良好的相似性，只在5，6，9，10，12号色谱峰的含量上存在一定差异。结论壳聚糖对参芪水煎液化学成分具有良好的纯化作用。
       【关键词】  参芪； 壳聚糖； 纯化； 多糖； 指纹图谱
       Influence of Chitosan Purification on the Components of Shenqi Aqueous Extract
       ZHANG Laihua，ZHU Shengshan，YUAN Xujiang*，WANG Bo，ZHANG Zhipeng，LIU Yan
       Guangdong College of Pharmacology， Guangzhou，Guangdong 510006，China
       Abstract：Objective To study the Chitosan purification influence on Shenqi aqueous extract"s components．MethodsBy means of determining polysaccharide and solids contents, orthogonal experiment and HPLC method were used to study and analyze. Results The content of Chitosan had significant influence in polysaccharide, and the best purification process was A3B1C2D3 , whose polysaccharide content and solids content achieved 49.26% and 55.58% respectively; the nine different technology fingerprints showed that those fingerprints had favourable similarity, and only had some diffrence on the number of 5、6、9、10、12 chromatographic peaks. ConclusionChitosan can play an excellent role in purification of Shenqi aqueous extract"s components.
       Key words： Shenqi；Chitosan；Purification；Polysaccharides；Fingerpint
        随着中药现代化的进一步发展，中药水提液的纯化技术是中药制剂前处理中最为关键的步骤，而中药水提液成分复杂，体积较大，有效成分含量低，杂质多，所以在保留有效成分的同时尽可能多的去除杂质成为了中药制剂现代化的瓶颈。近几年研究发现，水提醇沉法存在一些不足，乙醇沉淀物中仍含大量有效成分，且费用也高。壳聚糖澄清技术是一种高效、快捷、经济的中药水煎液纯化方法，在中药制剂澄清工艺上越来越受青睐［1，2］，但研究仍不够深入。本文以党参、黄芪为研究对象，采用正交法［3］，以总多糖含量、固含物的量为指标，结合HPLC指纹图谱分析技术［4］，研究壳聚糖澄清剂对参芪水煎液成分的纯化影响，为壳聚糖在中药复方制剂的前处理方面的研究提供基础和依据。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器Agilent 1100 液相色谱仪（含在线真空脱气机，低压四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，可变波长紫外检测器），电热恒温水浴锅(型号H·S·G-ⅡB-4)，电子分析天平(Sartorius BP211D，十万分之一天平)，Shimadzu UV-1700 分光光度计。
       1.2  试药党参、黄芪药材，由丽珠集团利民制药厂提供，经广东药学院中药开发研究所朱盛山教授分别鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula( franch.) Nannf.的干燥根和豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch．) Bge．var mongholieus (Bge．)Hsiao的干燥根。壳聚糖(上海伯奥生物科技有限公司)；D-无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所，批号为：110833-200503)；乙腈为色谱纯，水为三蒸水；磷酸、硫酸、苯酚、盐酸均为分析纯。
       2  方法和结果
       2.1  参芪水煎液的制备取党参、黄芪药材各1 kg ，分3次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2 次加8 倍量水煎煮1 h，第3 次加8 倍量水煎煮30 min。合并煎液，滤过，浓缩至每毫升药液含0.5 g生药，备用。
       2.2  壳聚糖澄清剂的配制称取1.0 g壳聚糖置100 ml量瓶中，用1%冰醋酸至刻度，配成1%的壳聚糖胶体溶液。
       2.3  正交实验
       2.3.1  正交因素的确定依据预实验结果，以药液浓度、澄清剂加入量、澄清温度和搅拌时间为考察因素，以总多糖含量和沉淀物去除率为指标，按照L9（34）正交实验进行研究，测定，计算，并对结果进行比较分析。各因素水平见表1。表1  正交实验因素水平表（略）
       2.3.2  正交实验根据因素设计表，分别取参芪水煎液制成相应药液浓度的溶液各50 ml，按照正交设计表（见表2）进行正交实验，分别加入1%的壳聚糖澄清剂溶液，在相应温度下搅拌一定时间，取出，冷藏24 h，离心（5 000 r/min，15 min），分别取出全部上清液，加水稀释定容至浓度为0.08 g/ml的溶液，得9份纯化溶液，滤过，备用。取出沉淀物，备用。每个条件平行做3 份。
       2.4  多糖含量测定
       2.4.1  对照品溶液的制备取葡萄糖对照品10 mg，精密称定，置于量瓶中，加水使溶解，摇匀，制成每毫升含1 mg的葡萄糖对照品溶液。
       2.4.2  葡萄糖标准曲线的绘制精密量取葡萄糖对照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml置于10 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，分别精密吸取2.0 ml于试管中（空白对照为纯水2.0 ml），各加入5%苯酚溶液1.0 ml，振摇混匀，在冰浴条件下加入浓硫酸5.0 ml，迅速振摇混匀，放置5 min，于100℃水浴中显色10 min,立即取出冷却至室温，加纯水定容至10 ml，照分光光度法［5］,在488 nm处测定吸光度。以吸光度(Y，A)对浓度(X，mg/ml)进行线性回归，得标准曲线方程：Y=10.905X+0.139 4；r=0.999 8。
       2.4.3  多糖含量测定
       精密吸取“2.3.2”项下的9份纯化溶液各50 ml，分别精密加入盐酸10 ml，水解3 h，用纯水定容至100 ml，滤过，精密吸取续滤液2 ml，用纯水定容至100 ml，作为供试品溶液。精密量取空白溶液（纯水）和供试品溶液各2 ml于试管中，按照“2.4.2”下从“各加入5%苯酚溶液1.0 ml…”开始，同法测定，在（488±2）nm处分别测定吸收度值，并计算多糖含量。
       2.4.4  固含物量的测定根据因素设计表，分别取参芪水煎液制成相应药液浓度的溶液各50 ml，水浴蒸干，再置105℃烘箱烘干至恒重，放冷，置干燥器中放置24 h，取出，测得固含物量W1。分别取“2.3.2”项下9 份上清液，水浴蒸干，105 ℃烘箱烘干至恒重，放冷，置干燥器中放置24 h，取出，测得固含物重W2。计算固含物的量。
       2.4.5  正交实验结果和分析壳聚糖澄清法实验结果分别见表2。表2  正交实验结果（路）表3  总多糖含量方差分析（略）表4  固含物的量方差分析（略）
        由表2～4结果可见，澄清剂用量对多糖含量存在较大影响（P＜0.01），以多糖含量为指标的最佳纯化条件为A3B1C2C3：药液浓度和絮凝温度对固含物的量存在较大影响（P＜0.01），以固含物的量为指标的最佳纯化条件为A3B1C3D1。综合比较分析上述结果，并考虑实际生产的需要，最后得最佳纯化工艺为澄清剂加入量15%，药液浓度为1∶5(g/ml)，絮凝温度60℃，搅拌时间15min。
       2.4.6  最佳纯化工艺验证取“2.1”项下水煎液3份，按照优选工艺条件进行重复性验证实验，结果表明正交实验优选的工艺条件较好，总多糖含量较高，固含物的量较低。见表5。表5  验证结果（略）
       2.5  HPLC指纹图谱分析
       2.5.1  色谱条件Gracesmart-C18柱（5 μm，4.6 mm ×250 mm）；流动相：采用梯度洗脱，A相为乙腈，B相为0.05%磷酸水溶液，流速：1.0 ml/min，检测波长：280 nm，柱温：30℃。梯度洗脱程序见表6，运行时间50 min。表6  梯度洗脱程序（略）
       2.5.2  波长的选择采用DAD对指纹图谱的200～ 800 nm检测波长进行紫外扫描，结果以280 nm波长进行分析的色谱图包含的信息量大，各色谱峰较好分离，50 min以后基本无色谱峰。
       2.5.3  色谱系统精密度的考察取一新制备的供试品溶液按上述色谱条件重复进样5次，记录色谱图，各色谱峰的相对保留时间RSD=0.9%～ 1.3%，相对峰面积RSD=0.9%～ 3.0% 。
       2.5.4  方法重复性的考察平行操作制备5份供试品溶液，分别进样测定，各个色谱峰的相对保留时间RSD=0.4%～ 0.9%，相对峰面积RSD=0.9%～ 3.0%。
       2.5.5  供试品溶液稳定性的考察实验结果表明，供试品溶液在室温放置24 h内稳定，各个特征峰的峰面积未发生明显变化(RSD＜3.0%)。
       2.5.6  分析和结果分别精密吸取“2.3.2”项下的9份纯化溶液各10 μl，注进高效液相色谱仪进行分析。结果见图1和图2。
        由图1和图2 结果可知，经比较分析所有测定和记录的色谱图，9个指纹图谱中具有12个特征性较强且较稳定的共有峰，在含量上有些色谱峰存在少量差异，主要表现在5，6，9，10，12号色谱峰，但从指纹图谱全貌上看，不同工艺纯化液的指纹图谱具有良好的相似性，表明壳聚糖对参芪水提液中成分影响较少。
       3  讨论
        中药提取纯化的最理想条件是在尽可能低的固含物的量的同时尽可能多的保留有效成分。本文研究结果表明，壳聚糖用量对参芪水煎液中多糖具有显著影响，而对固含物的量没有显著影响，固含物的量在53% ～ 67%之间，可见固含物的量较低。由正交法可知最佳纯化条件为A3B1C2D3，该工艺多糖含量为49.26%，固含物的量为55.58%。
        高效液相指纹图谱研究表明，在280 nm波长检测得到的色谱峰信息量较大，色谱峰主要以黄酮类成分为主。通过比较9个不同工艺纯化液的指纹图谱色谱图，从色谱图全貌和出峰数上看，各色谱图具有良好的相似性，但也存在一定差异，主要表现在5，6，10，12号色谱峰的含量上，但是否存在影响规律有待进一步研究。
        实验结果表明，壳聚糖对参芪水提液中多糖含量和黄酮类部位成分具有良好的纯化作用。党参黄芪水煎液中还有大量的皂苷类等成分，壳聚糖对该类成分是否存在影响，有待于进一步研究。壳聚糖虽在水溶液中能产生絮凝而沉淀出来，但也部分残留在水中，其残留量多少和检测方法也有待于进一步研究。
       【参考文献】
         　［1］陈 英，李永吉，程淑云，等. 壳聚糖絮凝法精制红花水提液工艺的研究［J］.时珍国医国药，2007，18(5):1167.
       
       ［2］吴 琼，李三鸣，姜爱萍，等.壳聚糖絮凝法精制红景天提取液［J］.沈阳药科大学学报，2005，22(3):220.
       
       ［3］沈嘉茵，袁旭江，朱盛山，等.正交法对蟾酥提取工艺影响研究［J］.中国实验方剂学杂志，2008，14(2):27.
       
       ［4］袁旭江，霍务贞，朱盛山，等.广藿香HPLC指纹图谱的初步研究［J］.中药新药与临床药理，2006，17(3):195.
       
       ［5］国家药典委员会.中国药典，一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录VA.