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       【摘要】 
       目的建立饭汤子总黄酮的含量测定方法，对饭汤子中的总黄酮成分进行定量研究。方法采用紫外分光光度法对饭汤子总黄酮的含量进行研究。结果采用50%乙醇热回流提取饭汤子中的总黄酮，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色系统进行含量测定，线性范围为23.5～116.5 μg/ml，r=0.999 8，平均加样回收率为101.1%，RSD=1.08%（n=5），饭汤子药材中平均总黄酮含量为11.83%，不同产地的饭汤子药材总黄酮含量差异较大。结论此含量测定方法操作简便，快捷，重复性好，为饭汤子药材质量控制提供了依据。
       【关键词】  饭汤子； 总黄酮
       Determination of Total Flavonoids in Viburnum setigerum
       WEI Songji, MENG Wanxiang, DAI Zhonghua
       (Guangxi Traditional Chinese Medical University,Guangxi Nanning 530001)
       Abstract:ObjectiveTo establish a method  for determination of total flavonoids in Viburnum setigerum.MethodsThe contents of total flavonoids in the samples were assayed by ultraviolet spectroscopy.Results The total flavonoids were extracted with evaporative reflux  from Viburnum setigerum by 50% alcohol, its content was determined by ultraviolet spectroscope with NaNO2-Al(NO3)3-NaOH system, the linear range varied from 23.5～116.5 μg/ml，r=0.999 8，the average recovery was 101.1%，RSD=1.08%（n=5）. The average content of total flavonoids in Viburnum Setigerum was 11.83%, and the contents of total flavonoids in Viburnum setigerum were different because of their different regions. ConclusionThe method is easy to operat and is repeatable, which provides a basis for quality control of Viburnum setigerum.
       Key words:Viburnum setigerum；  Total flavonoids
       
       饭汤子为忍冬科荚蒾属植物茶荚蒾Viburnum setigerum Hance的根，又名鸡公柴、跑路杆子、水茶子、霜降子、虎柴子等,味微苦，性平，有清热利湿、活血止血之功效，主治小便白浊、肺痈、吐血、热瘀经闭［1，2］。饭汤子为广西壮医用于治疗乙型肝炎的常用壮药，疗效确切。目前仅有其护肝作用的实验研究报道［3］。饭汤子化学成分未见报道，经化学成分预实验发现主要含有糖类、鞣质、有机酸、黄酮类、蒽醌类、内酯类。黄酮类化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝护肝、调节免疫等药理作用［4］，很可能是饭汤子护肝作用的有效成分。而有关饭汤子总黄酮含量测定方面的研究未见报道。本文通过紫外分光光度法对饭汤子总黄酮进行了定量测定，为饭汤子药材的质量控制提供参考依据。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器Sartorius BP211D电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；超声波清洗机SK2200LHC（上海科导超声仪器有限公司）；Agilent8453紫外可见分光光度计（美国安捷伦）。
       1.2  样品饭汤子药材，经广西中医学院韦松基教授鉴定为忍冬科荚蒾属植物茶荚蒾Viburnum setigerum Hance。
       1.3  试剂芦丁对照品（含量测定用，0080-9705，中国药品生物制品检定所）；其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  提取溶剂的考察取饭汤子粗粉（过20目筛）3份，每份0.5 g，精密称定，分别加入甲醇、70%乙醇、水各50 ml，超声提取1 h，滤过，滤液置于50 ml容量瓶中，用相应的溶剂定容至刻度。分别精密吸取以上制备溶液2 ml置于25 ml容量瓶，加入5％NaNO2溶液1.0 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入4％NaOH溶液10.0 ml，分别以相应的溶剂定容至刻度，摇匀，放置15 min，再分别以相应的溶剂为空白对照，在500 nm波长处测定紫外吸收峰峰位和吸光度，(见表1)。结果表明，饭汤子的乙醇提取液总黄酮含量最高，故选择乙醇为提取溶剂。表1  提取溶剂的考察（略）
       2.2  溶剂浓度的考察取饭汤子粗粉（过20目筛）5份，每份0.5 g，精密称定，分别加入30％，50％，70％，90％乙醇液及无水乙醇各50 ml，超声提取1 h，滤过，滤液定容至50 ml容量瓶中，用相应浓度的乙醇溶液定容至刻度。分别精密吸取以上制备溶液2 ml置于25 ml容量瓶，加入5％NaNO2溶液1.0 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入4％NaOH溶液10.0 ml，再分别以相同浓度的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 min，以相同浓度的乙醇溶液作为空白对照，在500 nm波长处测定紫外吸收峰峰位和吸光度，结果见表2。结果表明，50%乙醇提取液的总黄酮含量最高，故选择提取溶剂为50%的乙醇溶液。表2  溶剂浓度的考察（略）
       2.3  提取方法的考察
       2.3.1  方法一索氏提取法：精密称取饭汤子粗粉0.5 g，加入50 ml 50％乙醇溶液，置索氏提取器中，提取1 h，滤过，滤液移至50 ml容量瓶中，用50％乙醇定容至刻度，摇匀，待含量测定。
       2.3.2  方法二回流提取法：精密称取饭汤子粗粉0.5 g，加入50 ml 50％乙醇溶液，水浴加热回流提取1 h, 滤过，滤液移至50 ml容量瓶中，用50％乙醇定容至刻度，摇匀，待含量测定。
       2.3.3  方法三超声提取法：精密称取饭汤子粗粉0.5 g，加入50 ml 50％乙醇溶液，超声提取1 h，滤过，滤液移至50 ml容量瓶中，用50％乙醇定容至刻度，摇匀，待含量测定。
       2.3.4  方法四冷浸提取：精密称取饭汤子粗粉0.5 g，加入50 ml 50％乙醇溶液，冷浸24 h, 滤过，滤液移至50   ml容量瓶中，用50％乙醇定容至刻度，摇匀，待含量测定。
       
       分别取上述提取液各2 ml，经显色后在500 nm处测定紫外吸收。结果见表3。结果表明，回流提取法提取的饭汤子提取液中总黄酮含量最高，故选择回流提取法。表3  提取方法的考察（略）
       2.4  含量测定［5］
       2.4.1  供试品溶液的制备精密称取饭汤子粗粉0.5 g，加入50 ml 50％乙醇溶液，水浴加热回流提取1 h, 滤过，滤液定容至50 ml容量瓶中，用50％乙醇定容至刻度，摇匀，备用。
       2.4.2  标准溶液的制备精密称取干燥至恒重的芦丁对照品23.3 mg，用50％乙醇溶解并定容于100 ml容量瓶中，摇匀，得浓度为0.233 0 mg/ml的标准溶液。
       2.4.3  显色系统的筛选
       
       方法1：分别取3.0 ml的芦丁标准溶液和样品溶液于25 ml的容量瓶中，加0.1 mol/L的三氯化铝溶液6.0 ml和1 mol/L的醋酸钠溶液9.0ml,用50％乙醇定容。
       
       方法2：分别取3.0 ml的芦丁标准溶液和样品溶液于25 ml的容量瓶中，加5％的硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀5 min，再加10％的三氯化铝溶液1.0 ml，摇匀5 min，再加4％的NaOH溶液10 ml，用50％乙醇定容，摇匀5 min。
       
       方法3：分别取3.0 ml的芦丁标准溶液和样品溶液于25 ml的容量瓶中，加5％的亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀5 min，再加10％的硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀5 min，再加4％的NaOH溶液10 ml，用50％乙醇定容，摇匀10 min。通过比较，方法3显色灵敏、稳定，故采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色系统。
       2.4.4  测定波长的确定精密吸取芦丁对照溶液和供试品溶液各5.0 ml，分别置于25 ml容量瓶中，定容，摇匀后分别于400～800 nm范围内扫描，两种溶液在400～800 nm范围内均无最大吸收峰。另取芦丁对照溶液和供试品溶液各5.0 ml，分别置于25 ml容量瓶中，加入5％NaNO2溶液1.0 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入4％NaOH溶液10.0 ml，用50％乙醇定容，摇匀，置室温放置10 min后分别于400～800 nm范围内扫描。结果发现，芦丁对照品溶液在500 nm处有较大吸收峰，供试品溶液也在500 nm处有最大吸收峰，如图1。故将500 nm确定为测定波长。另制备不含样品的阴性对照溶液，同法显色后在400～800 nm范围内扫描，溶液在500 nm处无吸收峰，不影响测定，故选择测定波长为500 nm。
       2.4.5  标准曲线的制备精密吸取芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置于10 ml容量瓶中，各加50％乙醇至5 ml，再加入5％NaNO2溶液0.5 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入10％Al(NO3)3溶液0.5 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入4％NaOH溶液4.0 ml，用50％乙醇定容，摇匀，置室温放置10 min，以第一份溶液为空白，在紫外分光光度计500 nm处检测吸收度，以吸收度A为纵坐标，芦丁溶液的浓度C(mg/ml)为横坐标，绘制浓度-吸光度标准曲线，如图2。得回归方程为：A=10.824C-0.019 9，r=0.999 8，线性范围为23.5～116.5 μg/ml。见表4。表4  标准曲线的制备（略）
       2.4.6  测定方法精密吸取供试品溶液2 ml，置于25 ml容量瓶中，加50％乙醇至6 ml，加入5％NaNO2溶液1.0 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0 ml，摇匀，置室温放置5 min，再加入4％NaOH溶液10.0 ml，用50％乙醇定容，摇匀，置室温放置10 min。以相应的溶液为空白对照，在500 nm处测定吸光度，根据标准曲线方程计算总黄酮的含量。
       2.4.7  精密度实验精密吸取供试品溶液1.0 ml,各5份，分别置于25 ml容量瓶中，余项同“2.4.6”项下从“加50％乙醇至6 ml……置室温放置10 min”操作，以50％乙醇为空白对照，测定吸光度。结果得RSD=0.90%（n=5）,说明仪器系统的精密度良好。
       2.4.8  稳定性实验照“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 ml至25 ml容量瓶中，余项同“2.4.6”项下从“加50％乙醇至6 ml……置室温放置10 min”操作，以50％乙醇为空白对照，500 nm为测定波长，分别于0，5，10，15……60 min测定吸光度，结果RSD为1.5%。说明该样品经显色后在60 min内稳定。
       2.4.9  重复性实验精密称取饭汤子粗粉0.5 g，各5份，按“2.4.1”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。各精密吸取1 ml，分别置25 ml容量瓶中，余同“2.4.6”项下从“加50％乙醇至6 ml……置室温放置10 min”操作，以50％乙醇为空白对照，于500 nm处测定吸收度，结果平均吸光度值为0.641 92，RSD为1.4%，表明该方法重现性良好。
       2.4.10   加样回收实验取已知浓度的供试品溶液5ml置于25 ml容量瓶中，用50%的乙醇溶液定容至刻度。精密吸取上述溶液3ml于25 ml容量瓶中，各5份，分别精密加入已知浓度的对照品溶液1，2，3，4，5 ml，余同“2.4.6”项下从“加入5％NaNO2溶液……置室温放置10 min”操作，于500 nm处测定吸收度，计算回收率，结果平均回收率为101.1%，RSD为1.08%。结果见表5。表5  加样回收实验结果（略）
       2.4.11  样品的含量测定取不同产地的饭汤子粗粉，照“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，精密吸取2 ml至25     ml容量瓶中，余同“2.4.6”项下从“加50％乙醇至6 ml……置室温放置10 min”操作，以50％乙醇为空白对照，于500 nm处测定吸收度。结果见表6。结果表明高峰产地的饭汤子药材中总黄酮含量最高，为14.16%，老虎岭产地的饭汤子药材中总黄酮含量最低，为9.7%。表6  同产地饭汤子药材总黄酮含量测定结果（略）
       3  讨论
          
       黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇等溶剂中，故选择甲醇、乙醇作为提取溶剂。但实验中我们发现乙醇的提取效果比甲醇好，而且乙醇溶液的提取效率比无水乙醇高，通过实验比较我们发现50%乙醇提取液所含总黄酮含量最高。通过比较索氏提取法、回流提取法、超声提取法、冷浸提取法4种方法，发现回流提取法的效率明显高于其他方法，故采用回流提取。
       
       大多数黄酮类化合物的紫外吸收光谱由两个主要的吸收带组成，出现在300～400 nm之间的吸收带称为带Ⅰ，是由B环桂皮酰基系统的电子跃迁引起的吸收，出现在240～280 nm之间的吸收带称为带Ⅱ，是由A环苯甲酰基系统的电子跃迁引起的吸收［6］。加入铝盐可使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的配合物，使带Ⅰ明显红移，吸光度明显增大。崔敬浩等［5］选用了常用的3种铝配合物显色系统来显色测定总黄酮含量。通过比较，发现NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色系统显色灵敏，且吸收值稳定，故采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色系统。
       
       本实验采用50%乙醇回流提取饭汤子的总黄酮，以芦丁为对照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色剂测定饭汤子中总黄酮的含量，在线性范围为23.5～116.5 μg/ml，r=0.999 8，平均加样回收率为101.1%，RSD=1.08%，该方法准确度高，操作简单，重现性好。通过对不同产地的饭汤子药材进行含量测定，发现不同产地的饭汤子总黄酮的含量有一定差异，由此可见不同地理环境对植物的化学成分含量有一定影响。
       【参考文献】
         　［1］中华本草编委会.中华本草(7)［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：561．
       
       ［2］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编,下册［M］.北京：人民卫生出版社，1983：813．
       
       ［3］韦松基，郑作文，庞宇舟，等．饭汤子对小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.广西中医药，2005，28（3）：51．
       
       ［4］唐栩,许东晖,梅雪婷,等.26种黄酮类天然活性成分的药理研究进展［J］.中药材,2003,26(1):46.
       
       ［5］崔敬浩,杨星昊,丁安伟,等.小蓟、小蓟炭中黄酮类成分的含量测定和薄层鉴别［J］.四川中医,2006,24(3):32.
       
       ［6］中药化学编委会.中药化学［M］.北京：中国中医药出版社，2004：155.