【摘要】 目的克隆阳春砂萜类生物合成途径上游关键酶——3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC：1.1.1.34)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达。方法用基于RT-PCR的方法从阳春砂叶片中获得编码HMGR的cDNA全长序列，克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异。结果获得了全长2 023 bp的编码阳春砂HMGR的cDNA序列，命名为AvHMGR(GenBank登记号：FJ455511)。AvHMGR编码的蛋白与其他植物来源的HMGR有很高相似性，含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序，N-端有两个跨膜结构域。保守功能结构域的分析结果表明AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族。AvHMGR在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达，且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达。结论从阳春砂中克隆了AvHMGR基因，为进一步鉴定基因功能、探明阳春砂萜类生物合成的基因调控机制打下基础。
【关键词】 阳春砂; 萜类化合物; 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR); 基因克隆; 基因表达
Clone and Analysis of Gene Encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A Reductase from Amomum villosum
YANG Jinfen1,2,
HE Guozhen2,3,
Megha Nath Adhikari2,3,
XU Hui1,2,
HE Rui1,2,
ZHAN Ruoting1,2,
CHEN Weiwen1,2*
(1. Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou，510006, China; 2. Key Laboratory of Chinese Medicine Resources of Ministry of Education, Guangzhou, 510006, China; 3. College of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou，510006, China)
Abstract：ObjectiveTo clone the gene encoding 3-hydroding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase(HMGR,EC:1.1.1.34),the key enzyme of biosynthetic pathways of terpenoids,from Amomum villosum and analyze its function and expression in different tissues of Amomum villosum.
MethodsMethod based on RT-PCR by using degenerate primers and rapid amplification of cDNA ends(RACE) was used to clone gene.Bioinformatic analysis was used to identify the gene.Semi-quantitative RT-PCR was carried out to analyze the expressional difference of the gene in different tissues.
ResultsA cDNA encoding HMGR(designated as AvHMGR,GenBank accession number FJ455511) was isolated from leaves of Amomum villosum for the first time.The full-length cDNA of AvHMGR was 2023 bp containing an open reading frame(ORF) of 1713 bp encoding 571 amimo acids.Bioinformatic analysis revealed that the deduced protein AvHMGR had extensive sequence similarities to other plant HMGRs and was more homologous with HMGRs from monocotyledonous plants.AvHMGRs had two NADPH binding motifs and two HMG-CoA binding motif.Two transmembrane regions were found in its N-terminal region.Result of CDD search indicated that it belonged to the HMGR super-family.AvHMGR expressed in leaves,stems,roots,pericarps and seeds of Amomum villosum and lower transcription level was observed in leaves than that of other tissues.
ConclusionAvHMGR encodes HMGR in Amomum villosum.
Key words：Amomum villosrm; Terpenoids; 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase(HMGR); Gene colning; gene expression
砂仁是我国著名的“四大南药”之一，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎等功效。阳春砂Amomum villosum Lour.是砂仁药材的主要来源植物[1]。砂仁化湿行气的主要药效物质为挥发油，其主要成分为萜类化合物[1,2]。近年来，萜类化合物代谢的研究成为目前药用植物次生代谢研究领域的热点之一。随着分子生物学的发展，萜类化合物生物合成途径相关酶类的编码基因也不断被克隆和研究[3～5]。
甲羟戊酸途径(mevalonate pathway，简称MVA途径)和丙酮酸/磷酸甘油醛途径(pyruvate/glyceraldehyde-3-phosphate pathway，简称DXP途径)是植物萜类化合物生物合成的两条途径，MVA途径在细胞质中进行，而DXP途径发生在质体中[3]。两条途径并不完全独立，而是有着相互关联，一条途径被抑制后，能被另一条途径部分补偿[6，7]。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC：1.1.1.34)催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)转化为甲羟戊酸的不可逆反应是MVA途径的第1个限速步骤，是萜类生物合成上游途径中的重要调控点[8]。HMGR基因已经从长春花Catharanthus roseus[9]，水稻Oryza sativa[10]，橡胶树Hevea brasiliensis[11]，桑树Morus alba[12]，大戟Euphorbia Pekinensis[13]，马铃薯Solanum tuberosum[14]，喜树Camptotheca acuminata[15]，杜仲Eucommia ulmoides[16]，辣椒Capsicum annuum[17]，银杏Ginkgo biloba[18]，红豆杉Taxus media[19]等多种植物包括药用植物中克隆。
本研究用简并引物RT-PCR结合RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法，从阳春砂叶片中克隆了编码HMGR的基因，通过生物信息学分析初步鉴定了基因的功能，用半定量RT-PCR法分析了基因在不同组织中的表达差异，为保护阳春砂的基因资源，进一步探明阳春砂药效物质萜类成分生物合成的调控机制打下基础。
1 材料 1.1 植物材料用于基因克隆的阳春砂引种自广东阳春市砂仁试验示范场，栽种于广州中医药大学大学城药圃。
用于基因表达分析的阳春砂幼苗培养方法：取阳春砂种子用细砂搓去假种皮，浸种24 h后播种于盛有营养土与粗砂比例为3∶1的基质的育苗盆中室温光照培养，待幼苗长出2～4片真叶后间苗，每盆(直径12 cm)留取生长一致的苗2～3株，待苗龄约6个月(长出7～9片真叶)时取第1位完全展开叶、茎和根，用于基因表达分析。阳春砂成熟果实取自阳春春湾，液氮速冻后-70℃保存备用。
1.2 试剂植物RNA提取试剂盒(北京普利莱基因技术公司);PrimeScript RT-PCR Kit、1st Strand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、克隆载体pMD18-T(宝生物工程大连有限公司);柱式植物RNAout试剂盒(北京天泽基因公司);克隆载体pGEM-T(美国，Promega);SMART RACE Kit(美国，Clontech);大肠杆菌E.coli菌株DH5α(本实验室保存);Taq DNA聚合酶、DNA回收试剂盒(北京赛百盛生物工程公司);引物由上海生工生物工程公司合成;测序由上海生工生物工程公司和上海英潍捷基(invitrogen)公司完成。
2 方法 2.1 目的基因核心片段的扩增
2.1.1 简并引物设计 从GenBank上检索来源于单子叶植物的HMGR序列，获得水稻、玉米、薯蓣的HMGR序列(登记号分别为NM-001070076，Y09238，DQ017377)。用Omiga2.0软件对上述序列进行比对，根据其高度同源区域设计2对用于嵌套PCR的简并引物AH1，AH3和AH2，AH4。引物序列见表1。
2.1.2 总RNA的提取取0.1 g新鲜叶片，用植物RNA提取试剂盒，参照说明书的方法提取总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性，测定OD260与OD280，确定总RNA的浓度与纯度。
2.1.3 RT-PCR取总RNA 2 μg，用PrimeScript RT-PCR Kit，参照说明书的方法，以Oligo(dT)为引物进行反转录。下一步以反转录产物为模板，以AH1、AH3为引物进行PCR。反应体系(20 μl)：Ex Taq酶(5 U·μl-1) 0.1 μl，10×PCR buffer 2 μl，dNTP(10 mM) 1.5 μl，上游引物(10 μM) 0.75 μl，下游引物(10 μM) 0.75 μl，反转录产物1.5 μl，ddH2O 13 μl。PCR反应程序：94℃ 3 min;94℃ 0.5 min，54℃ 0.5 min，72℃ 1 min，37个循环;72℃ 5 min。以引物AH2、AH4进行2nd PCR，模板取1st PCR产物1 μl，退火温度为53℃，其余与1st PCR相同。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认特异条带后，按比例扩大体积至100 μl进行PCR。用DNA回收试剂盒，参照说明书的方法回收PCR产物，用相应的简并引物进行测序。
2.1.4 核心片段的确认登陆NCBI/BLAST(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，将测序结果进行Blastn(nucleotide blast)检索，检验所获片段与已知的其他植物HMGR序列的相似性。
2.2 目的基因3’端及5’端的克隆
2.2.1 RACE引物的设计用于3’-RACE的反转录引物R3以及用于PCR的下游引物R3P1见表1。根据“2.1.4”项下获得的核心片段序列和RACE试剂盒的引物设计要求，设计相应的3’-RACE上游引物AH31和5’-RACE下游引物AH51、AH52。见表1。
2.2.2 3"-RACE以总RNA为模板、R3为引物进行反转录。再以R3P1、AH31为引物，参照前“2.1.3”项下的PCR反应体系及程序，调整相应的退火温度和延伸时间进行PCR。回收PCR目的片段，连接至pMD18-T载体，热击法[20]转化E.coli DH5α，以经PCR检测的阳性菌落用载体通用引物测序。
2.2.3 5"-RACE用SMART RACE Kit，参照说明书的方法进行反转录，再以试剂盒中的UPM和NUP为上游引物，分别与目的基因的5’-RACE特异引物AH51、AH52配对，以LA Taq酶进行PCR。回收PCR目的片段，克隆至pGEM-T载体，用载体通用引物测序。
2.3 cDNA全序列的拼接及编码区的克隆用Omiga2.0软件，对3’-RACE和5’-RACE的测序结果进行分析，去除载体序列，利用NCBI的“Blast 2 Sequences”功能，将3’和5’端序列分别与“2.1.4”项下获得的核心序列进行比对和拼接，获得cDNA全长序列，再用Omiga2.0软件分析其开放阅读框架(ORF)，翻译成氨基酸序列。用NCBI的Blastp程序对所获的氨基酸序列进行同源检索，初步确认获得的翻译蛋白是否为HMGR的同源蛋白及其完整性。根据cDNA全序列中编码区的两侧序列设计引物AHO1和AHO2(表1)，以“2.1.3”项下获得的反转录产物为模板，扩增编码区全长。将回收片段克隆至pGEM-T载体，选2个以上阳性克隆进行测序和序列分析。表1 阳春砂AvHMGR克隆所用引物
2.4 基因编码蛋白分析及序列提交 用DNAstar5.0软件分析目的基因编码蛋白的分子量、等电点等理化性质。登陆
http://hc.ims.u-tokyo.ac.jp/iPSORT/，采用iPSORT运算法则对蛋白进行亚细胞定位预测。登陆
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，对蛋白进行跨膜结构域在线预测。利用NCBI的Blastp程序对氨基酸序列进行同源检索。登陆
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml，利用保守功能域数据库(conserved domain database，CDD)进行蛋白保守功能域的在线预测[21]。用DNAMAN5.0软件进行氨基酸序列的多重比对以及系统发育树的绘制。登陆
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/，向GenBank提交AvHMGR的cDNA序列及其编码的氨基酸序列。
2.5 基因表达分析
2.5.1 RNA提取叶片、根和茎的总RNA提取按照“2.1.2”的方法进行。用柱式植物RNAout，参照说明书的方法进行果皮和
种子团总RNA的提取。
2.5.2 反转录用1st Strand cDNA Synthesis Kit，参照说明书的方法进行。
2.5.3 半定量PCR根据芭蕉和三七的18S rRNA基因序列(EF376005和D85171)的比对结果，设计引物18SF、18SR(表2)，扩增半定量RT-PCR体系的内参照18S rRNA。设计引物AHR2、AHR3(表2)，扩增目的基因片段(约640 bp)。以反转录产物为模板进行半定量PCR。反应体系(20 μl)：10×PCR buffer 2 μl，Dye(PCR染料)2 μl，dNTP(10 mM)1.5 μl，上游引物(10 μM)0.5 μl，下游引物(10 μM)0.5 μl，Taq DNA聚合酶(5U·μl-1)0.2μl，根据18S rRNA的扩增结果调整相应模板的用量，灭菌超纯水补足体积。PCR反应程序：94℃ 2 min;94℃ 0.5 min，55℃ 0.5 min，72℃ 1 min，29个循环(18S rRNA)或30个循环(AvHMGR)。每个反应取5 μl PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测产物亮度。每个反应重复3次以上。表2 AvHMGR半定量RT-PCR所用引物
3 结果 3.1 RNA提取结果从阳春砂嫩叶中提取总RNA，电泳结果如图1所示，28S和18S rRNA条带清晰，无DNA污染，RNA浓度约为1μg·μl-1。
3.2 AvHMGR核心片段扩增及3’-RACE、5’-RACE结果如图2 所示，1st PCR和2nd PCR分别获得约650 bp的目的片段。1st PCR产物测序结果获得618 bp的序列，Blastn检索结果显示，该序列与其他植物来源的HMGR序列有较高相似性(75%～77%)。M.DL2000 DNA marker M. DL2000 DNA marker1，2. 叶片总RNA 1. 2nd PCR 2. 1st PCR图1 阳春砂叶片 图2 AvHMGR核心总RNA电泳图 片段的扩增
通过3’-RACE获得约750 bp的片段(图3A)，测序得到以polyA结尾的761 bp的序列，Blastn检索结果显示，该序列与其他植物来源的HMGR序列3’端有较高相似性(69%～78%)。
通过5’-RACE获得约1 200 bp的片段(图3B)，测序得到1 222 bp的序列，Blastn检索结果显示，该序列与其他植物来源的HMGR 5’端序列有较高相似性(74%～80%)。
3.3 AvHMGR全长cDNA的拼接及其编码区的克隆将克隆获得的5’端1 222 bp、核心片段618 bp与3’端 761 bp的序列进行拼接，获得了AvHMGR的cDNA全长，共2 023 bp，包含5’ 端92 bp的非编码区、1 713 bp的ORF和3’端218 bp的非编码区，最后以polyA结尾，编码571个氨基酸。
以引物AHO1和AHO2扩增获得编码区(图3C)，测序得到1 775 bp的插入序列。2个阳性克隆的测序结果验证了全长cDNA拼接序列的正确性。向GenBank提交阳春砂AvHMGR的cDNA全序列及其编码的氨基酸序列，获得序列登记号FJ455511及对应的蛋白序列登记号ACR02667。
3.4 AvHMGR编码蛋白的分析 根据软件分析的结果，AvHMGR编码蛋白的分子量为60.5 kDa，等电点为7.405。亚细胞定位预测结果显示，AvHMGR蛋白的N-端没有信号肽或线粒体、叶绿体靶向转运肽。跨膜结构域预测结果显示，在其N-端有两个跨膜结构域(图5)，第一个位于第36位异亮氨酸(I)和第55位甲硫氨酸(M)之间，第二个位于第68位亮氨酸(L)到第90位亮氨酸(L)之间，两个跨膜结构域之间的肽链位于膜内，之外的肽链主要位于膜外。AvHMGR具有NADPH结合位点“DAMGMNM”和“GTVGGGT”，也具有和底物HMG-CoA的结合位点“ELPIGYVQLP”和“TTEGCLVA”(见图5)。
3.5 AvHMGR与其他植物HMGR蛋白的同源性及系统进化关系Blastp结果表明，AvHMGR蛋白与来源于其他植物的HMGR蛋白有广泛相似性。表3列出了AvHMGR与文献报道的其他10个植物HMGR蛋白[10～19]的序列比对结果，相似性达到77%～89%。M1. DL2000 DNA markerM2. 250 bp DNA marker1. 3’端 2. 5’端 3.编码区图3 AvHMGR 3’端、5’端以及编码区的扩增表3 AvHMGR与其他10个植物HMGR蛋白相似性比较
AvHMGR与其他10个植物HMGR的系统进化关系分析结果如图4所示，11种HMGR的分子进化关系与其来源植物的亲缘关系基本一致，AvHMGR与同为单子叶植物的水稻OsHMGR聚为一枝。图4 AvHMGR与其他10个植物HMGR蛋白的系统进化树对AvHMGR与水稻、杜仲和大戟的HMGR多重比对结果(图5)显示，它们的相似保守区域主要集中在N-端第30至第100位氨基酸区域和第155位氨基酸之后的C-端区域。推测N-端的保守区域可能与HMGR蛋白的跨膜结构域相关，而C-端保守区域与HMGR蛋白的催化功能相关。
3.6 AvHMGR功能预测用AvHMGR的序列进行CDD搜索，结果显示AvHMGR蛋白归属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶超级家族(cl00205: HMG-CoA_reductase Super-family)中的HMGRⅠ类酶(cd00643：Hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase, class I enzyme)，为同源四聚体。
3.7 AvDXR1半定量RT-PCR结果如图6所示，根据半定量RT-PCR的结果，AvHMGR在茎、根、果皮和种子团中的表达量高于在叶片中的表达量。黑色、深灰色和灰色描影分别示序列相似性为100%、≥75%和≥50%;AvHMGR、OsHMGR、EuHMGR与EpHMGR分别来源于阳春砂、水稻、杜仲和大戟;上划线区域示两个跨膜结构域，带星号标注的4个序列分别为NADPH结合位点“DAMGMNM”和“GTVGGGT”， 及HMG-CoA结合位点“E(L/M)P(I/V)G(Y/F)(V/L)Q(L/I)P”和“TTEGCLVA”图5 AvHMGR与OsHMGR、EuHMGR、EpHMGR的多重比对1. 叶 2. 茎 3. 根 4. 果皮 5. 种子团图6 AvHMGR在阳春砂不同组织中的半定量RT-PCR结果
4 讨论 本研究应用简并引物RT-PCR与RACE结合的方法，首次从阳春砂叶片中克隆了AvHMGR基因。AvHMGR基因cDNA全长2 023 bp，编码蛋白包含571个氨基酸，与其他植物来源的HMGR有较高相似性。对AvHMGR蛋白序列的CDD检索结果显示，AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原异构酶(HMGR)家族，这一类酶在萜类生物合成途径中催化甲羟戊酸的合成，在植物中是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控点。自然界存在两类HMGR，类型Ⅰ主要存在于真核生物，在其N-端有跨膜结构域，类型Ⅱ主要存在于原核生物，不具有跨膜结构，检索结果显示AvHMGR蛋白属于HMGRⅠ类酶。AvHMGR也具有植物HMGR典型的NADPH结合位点(NADPH为HMGR催化的还原反应提供还原力)，也具有底物HMG-CoA的结合位点，其中“TTEGCLVA”中的谷氨酸Glu在HMGR催化中具有重要作用[22]。HMGR是一类定位在内质网膜上的蛋白[8]，N-端具有两个跨膜结构域是目前克隆获得的植物HMGR编码蛋白的共有特征[22]。阳春砂AvHMGR蛋白的N-端也具有两个跨膜结构域，推测这与其定位于细胞质的内质网膜上，行使其催化功能相关。这与已知的MVA途径发生在细胞质中是相符的。通过以上生物信息学的分析，初步证明了克隆获得的AvHMGR是阳春砂萜类生物合成途径关键酶HMGR的编码基因。
EuHMGR在杜仲叶和茎部的表达量高于根部的表达量[16]，EpHMGR在大戟的根、茎、叶中均有表达，在根部的表达量最高[13]。本研究对AvHMGR在阳春砂不同组织中的表达分析显示，AvHMGR也在阳春砂的不同组织中广泛表达，在根、茎和果皮、种子团中的表达均高于在叶片中的表达。由于果实是阳春砂的主要药用部位，AvHMGR在果实中的表达对于阳春砂萜类生物合成的原位调控具有重要意义。
本研究克隆获得了阳春砂AvHMGR基因，分析了该基因在不同组织中的表达，为进一步鉴定该基因的功能打下基础，为将其应用于萜类药效成分生物合成的基因工程调控提供依据。
致谢：广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心刘艳、黄琼林、宁鑫、吴睿等研究生参与了植物培养、果实取样的工作，广东阳春市砂仁试验示范场苏景场长提供了阳春砂种苗，特此致谢。
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