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       【摘要】 
       目的通过观察桦褐孔菌水提取物对糖尿病豚鼠的体质量、饮水量，空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)等生化指标及对葡萄糖激酶(GK)表达的影响，初步探讨桦褐孔菌影响糖尿病豚鼠糖代谢的机理。方法选用成年雄性豚鼠48只，每组8只：正常组，桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组，阴性对照组及阳性对照组。链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制作豚鼠糖尿病模型，灌胃桦褐孔菌水提取物，观察体质量和饮水量的变化，治疗8周后，心脏取血测定FBG、HbA1c，取肝脏，用Western blot测定葡萄糖激酶的表达。结果桦褐孔菌治疗组饮水量显著减少，体质量增加较明显，FBG和HbA1c水平明显下降，葡萄糖激酶的表达增高明显，并且表现为剂量梯度依赖。结论桦褐孔菌对糖尿病豚鼠饮水量的改善、体质量的增加、降低血糖及降低血红蛋白的糖基化程度具有较明显的效果,可能和通过增强葡萄糖激酶的表达，进而加强葡萄糖的分解代谢过程有关。
       【关键词】  桦褐孔菌; 糖尿病豚鼠; 血糖; 葡萄糖分解代谢
       桦褐孔菌Inonotus obliquus Chaga别名白桦茸，主要分布于北纬45～50°的地区，在我国主要分布在黑龙江和吉林省长白山地区，民间广泛利用其防治癌症等多种疑难杂症[1]。近年来，国内外学者研究发现桦褐孔菌含有三萜类、类固醇、甾醇类、多糖类、木质素类、黑色素类、多酚类、鞘氨脂类似物、甘露醇、半单宁化合物、栓菌酸、生物碱、叶酸衍生物以及芳香物质等多种化学成分。目前，美国、日本、俄罗斯、波兰等国外研究机构应用桦褐孔菌提取物治疗糖尿病已成为热点，但此项研究国内报道较少。本实验通过测定糖尿病豚鼠饮水量、体质量、FBG和HbA1c等指标变化及葡萄糖激酶的表达，初步探讨桦褐孔菌对糖尿病豚鼠降低血糖生物化学及分子生物学机制，为桦褐孔菌的临床应用提供理论依据。
       1 材料
       1.1 动物Hartley雄性豚鼠80只，体质量400～500g,由延边大学医学部实验动物科提供。
       1.2 用药桦褐孔菌水提取物，由延边圣林菌业有限公司提供。
       1.3 试剂STZ(美国Sigma公司)，蛋白质提取纯化试剂盒(Bioss p1250)，GK单克隆抗体 (Santa Cruz,USA);其他试剂均应用国产优级纯试剂。
       1.4 仪器全自动生化分析仪(日立7600)，糖化血红蛋白分析仪(Sysmex GT)，电泳装置(Bio-rad)。
       2 方法
       2.1 制作糖尿病动物模型实验动物适应性喂养1周后,禁食不禁水12 h,一次性腹腔注射STZ 80 mg/kg(临用前用pH 4.5的柠檬酸缓冲液溶解,配成浓度为1%混合液,30 min内注射完),第7天禁食不禁水12 h,用乙醚麻醉后取眦静脉血,离心后取血清测FBG,取FBG≥8.83 mmol/L者作为糖尿病成模标准[2]。
       2.2 实验分组及药物处理取造模成功的糖尿病豚鼠48只(本实验造模成功54只)，按血糖和体质量随机分为阴性对照组(模型组)、桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组及阳性对照组(盐酸二甲双胍治疗组)，每组各8只，桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组分别灌胃桦褐孔菌提取物300，600，900 mg/kg。阳性对照组灌胃盐酸二甲双胍200 mg/kg，正常对照组和糖尿病模型组每天灌胃相同剂量的蒸馏水1次,连续8周。实验期间饲以标准饲料、自由饮水及新鲜蔬菜。
       2.3 实验观察及生化指标测量监测各组饮水量，每天测量饮水量，每隔7 d测量体质量。实验8周后，各组禁食不禁水12 h，麻醉后心脏取血测量生化指标 (FBG，HbA1c)。
       2.4 Western blot实验8周后，取豚鼠肝脏，利用蛋白质提取纯化试剂盒提取总蛋白质。提取的蛋白质进行10% SDS-PAGE电泳，每孔点样30 μl蛋白提取液(含30 μg总蛋白)，然后将电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上(4°C恒压100v，1.5 h)。用牛奶封闭室温1h后，用TBST清洗3次,5 min/次。加入1：1 000稀释的羊抗豚鼠GK单克隆抗体室温培育1h，再加入1∶200稀释的兔抗羊IgG二抗培育2h。取出膜后，TBST充分冲洗3次, 15 min/次。压片后加入ECL显色液，置于UVP图像成像仪中观察并分析结果。条件设置为曝光1，2，4 min，CCD自动获取图像。以β-actin作为内参对照。
       2.5 统计分析数据以±s表示，实验前后数据比较采用t检验，各组间进行单因素方差分析。实验数据处理均用SPSS16.0统计软件进行统计分析。
       3 结果
       3.1 实验组饮水量和体质量的变化实验前后相比较，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大、中剂量组的饮水量均显著减少(P<0.01);实验后，与阴性对照组比较，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大、中剂量组的饮水量显著减少(P<0.01)，并表现为浓度梯度依赖性;实验后，桦褐孔菌提取物大、中剂量组的饮水量和阳性对照组饮水量比较无显著性差异，实验后，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大剂量组的体质量与阴性对照组比较体质量增加明显(P<0.05)。结果见表1。表1 各实验组实验前后饮水量及体质量的比较与实验后饮水量及体质量的比较
       3.2 各实验组FBG和HbA1c的变化 实验前后相比较，阳性对照组的FBG水平显著下降(P<0.01)，桦褐孔菌提取物大、中剂量组的FBG均明显下降(P<0.05);实验后与阴性对照组比较，阳性对照组的FBG水平显著下降(P<0.01)，桦褐孔菌提取物大、中剂量组的FBG均明显下降(P<0.05);实验后与阴性对照组比较，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大、中剂量组的HbA1c均明显下降(P<0.05)，并表现出浓度梯度依赖性，阳性对照组与桦褐孔菌提取物大、中剂量组的HbA1c水平比较无显著变化，结果见表2。表2 各实验组实验前后FBG及HbA1c的比较与　　实验后FBG及HbA1c的比较
       3.3 各实验组GK表达的变化实验后，各实验组GK表达情况见图1，桦褐孔菌低剂量组和阴性对照组与正常组比较GK表达无明显变化，桦褐孔菌中、高剂量组与阴性对照组比较，GK表达显著增高，桦褐孔菌对GK表达的影响表现浓度梯度依赖性。阳性对照组的GK表达略有增高，但不及桦褐孔菌高剂量组的GK表达。图1 桦褐孔菌对GK表达的影响
       4 讨论
       糖尿病是一种内分泌紊乱引起的代谢性疾病。近年来，糖尿
       病的发病率日趋增加，其并发症引起的死亡率继心脑血管疾病、癌症之后居第3位。目前，已被证实的中药的降糖机制有:起胰岛素样作用或修复胰岛作用、促进糖有氧氧化和脂肪组织摄取糖、提高耐糖能力，增加肝糖原含量，抑制糖原分解，葡萄糖潜酶抑制作用、提高胰岛素敏感性、改善血液流变性、醛糖还原酶抑制作用、蛋白质非酶糖基化抑制作用等 [3]。本实验利用豚鼠制作STZ糖尿病模型，基于STZ具有能够直接破坏胰岛细胞导致胰岛功能衰竭，对其他组织毒性相对较少，实验动物存活率高的特点，并且，豚鼠和其他啮齿类动物比较，具有对药物非常敏感的特点。本实验结果表明桦褐孔菌中、高剂量组的饮水量、FBG、HbA1c明显减少，体质量明显增加，并且具有浓度梯度依赖性，提示桦褐孔菌提取物对糖尿病豚鼠的糖尿病症状有较好的治疗作用,这些内容和陈艳秋、张香花等[4，5]研究结果吻合。己糖激酶是葡萄糖分解的关键酶,共有4种亚型,其中存在于肝脏中的己糖激酶称为葡萄糖激酶。从Western blot 数据可以看出，桦褐孔菌提取物能够促进GK的表达，并且表现浓度梯度依赖性。现已发现桦褐孔菌含有三萜类、类固醇、甾醇类、多糖类、木质素类、黑色素类、多酚类、鞘氨脂类似物、甘露醇、半单宁化合物、栓菌酸、生物碱、叶酸衍生物以及芳香物质等多种化学成分。桦褐孔菌提取物能够促进GK的表达，是否和这些单体成分有关，这些成分是否以单体或复合体的形式参与GK表达的信号传导通路或转录调节过程，还有待于进行其他的相关实验加以确定。本实验阳性对照组(盐酸二甲双胍)的饮水量、FBG、HbA1c等指标变化较桦褐孔菌高剂量组显著，而对GK表达的影响没有桦褐孔菌高剂量显著，可能和其增加周围组织对胰岛素的敏感性,抑制肠壁细胞摄取葡萄糖等功能有关，阳性对照组GK表达略有增高表明盐酸二甲双胍可能通过其他中间环节间接影响GK的表达。从以上分析可以推测，桦褐孔菌提取物对糖尿病豚鼠具有较好的治疗作用，其机制之一可能是通过对GK表达的影响，促进葡萄糖的分解代谢过程，降低血糖和血红蛋白的糖化程度，改善糖尿病的症状。
       【参考文献】
         　[1] 黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌-桦褐孔菌[J].中国食用菌,2002,21(4):7.
       
       [2] 杨丽萍,周文江,卫志明. 链脲佐菌素诱发豚鼠糖尿病模型的研制[J].上海实验动物科学，2001,21(2):111.
       
       [3] 陈东凤.中药降血糖作用机理研究进展[J].中华实用中西医结合杂志,2009,22(9):540.
       
       [4] 陈艳秋,周丽洁,李 玉.桦褐孔菌人工培养菌丝体、菌核与野生菌核多糖的降血糖比较试验研究[J].食用菌,2006,28(3):52.
       
       [5] 张香花,孙东植,陈海月, 等.桦褐孔菌提取物对糖尿病大鼠生化指标的影响[J].中国食用菌,2008,27(5):41.