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       【摘要】 
       目的研究熊果苷/透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)交联载药微球的制备及性能测定。方法采用超声乳化法，以透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)交联衍生物为载体，制备熊果苷/HA-ADH微球。通过倒置生物显微镜、红外光谱仪、紫外分光光度计等对载药微球的形貌结构进行表征，并考察其载药量、包封率及体外释药性能。结果制备的熊果苷/HA-ADH微球成球和分散性好，载药量(DL%)为(8.33±1.52)%，包封率(LE)%为(67.37±1.64)%。较大的微球粒径、孔径，负载量高时具有较好的缓释效果，释放介质温度的变化对其释放行为影响较小。结论HA-ADH载药微球对熊果苷有较好的缓释效果，作为新型美白化妆品功能原料有较大的开发潜力。
       【关键词】  超声乳化法; 熊果苷; 透明质酸-己二酸二酰肼; 微球; 制备
       化妆品中的活性成分要达到营养、改善皮肤状况和预防皮肤疾病的功效，关键是活性物质必须透过角质层而达到相应的作用部位并维持一定的时间。因此，寻找促进功能性成分经皮吸收的方法成为开发疗效性化妆品的关键之一。天然高分子聚合物微球超微载体技术应用于化妆品生产，赋予了化妆品优异性能[1～7]。
       透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)是细胞外基质中广泛存在的蛋白多糖成分(分子结构见图1)，具有良好的生物相容性，有望成为理想的缓释、控释功效成分的载体材料。但是，纯HA易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等物理和生物特性，限制其作为功能成分载体的使用，需要使用化学交联修饰，以增大其分子量、延长降解时间，提高稳定性[8～14]。
       熊果苷(arbutin) 是高效的化妆品美白原料，它在人体内通过抑制酪氨酸酶活性来阻断黑色素前体多巴以及多巴醌的合成，有较好的美白效果。但将熊果苷直接添加到化妆品配方中，其透皮吸收能力不甚理想[15，16]。熊果苷的物理性状为白色针状结晶或粉末，易溶于热水、甲醇、乙醇及丙二醇、丙三醇的水溶液，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等，熔点：198～201℃，在酸性条件下不稳定，易被水解。熊果苷有两种差相异构体，即α及β型。分子结构为见图2。图1 透明质酸分子结构α-熊果苷 β-熊果苷图2 熊果苷分子结构
       近年来，超声乳化法在现代生物技术中得到了广泛的应用。超声能对不相溶的液-液和液-固非均相体系作用，从而使介质分子达到最大的分散效应。液体介质中，由于涡流或超声波的物理作用，液体中的某一区域会形成暂时负压区，这种空化气泡在液体介质中产生、溃陷或消失而形成空化作用。超声乳化被较普遍地认为是空化作用的结果[17，18]。
       本研究采用超声乳化法，以生物相容性极佳的己二酸二酰肼(ADH)作交联剂，制备HA-ADH凝胶，用于包裹熊果苷等美白功效成分，形成天然高分子聚合物微球，增强熊果苷的透皮吸收能力，并达到缓释和提高生物利用度等作用，为化妆品皮肤美白产品提供新型功效性原料。使用紫外-可见分光光度法考察微球在PBS缓冲液中的释药效能。
       1 材料与仪器
       1.1 材料
       熊果苷标准品(湖北襄西化学工业有限公司，化妆品级)，透明质酸(山东福瑞达生物化工有限公司，化妆品级)，已二酸二酰肼(ADH，海曲化工有限公司)，氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)，液体石蜡(白油)，异丙醇，Span-80，Tween-80，氯化钾(KCl)，磷酸氢二钠(Na2HPO4)，磷酸二氢钾(KH2PO4)。试剂除注明外均为分析纯，实验用水为双蒸水。PBS缓冲液，参照《中国药典》(2005年版)配制，pH值为7.3[19]。熊果苷样品标准溶液，以PBS缓冲液为溶剂，用熊果苷标准品配制浓度分别为1,2,5,10,15,20,25和30μg/ml的样品标准溶液。
       1.2 仪器分析天平，超声波细胞粉碎机，低速离心机，恒温振荡器，TP2A型透皮扩散实验仪，移液器(100～1 000 μl)，真空干燥箱，磁力搅拌器，紫外分光光度计，倒置生物显微镜、红外光谱仪。
       2 方法
       2.1 药物标准曲线的绘制使用紫外分光光度计，在190～400 nm波长范围对20 μg/ml浓度的熊果苷样品溶液进行扫描，确定最大吸收波长λmax。PBS溶液作空白对照，于最大吸收波长λmax处测定不同浓度C熊果苷样品标准溶液的吸收度值A，以A对C作标准曲线。
       2.2 熊果苷/HA-ADH微球的制备流程在浓度为1mol/L的NaCl溶液中溶解一定量的熊果苷[用量∶熊果苷/HA=1∶10(g/g)]，配制浓度为0.2%的HA水溶液(CHA)，待溶胀至均匀透明后加入熊果苷/NaCl溶液，用2.5 mol/L的NaOH浓溶液调pH至9。水相中，HA、熊果苷/NaCl和NaOH溶液分别占77%，20%和2%。以液体石蜡为油相介质，加入乳化剂/油相为1/100(g/g)的复配乳化剂(Span-80∶Tween-80=88∶12, V/V)。以水相和油相W/O=1/4(V/V)配成240 ml浊液，加入浓度为0.1%、占水相体积1%的ADH溶液，经400 W声波乳化，工作时间10 s×90次，间歇10 s。用磁力搅拌器搅拌4 h待交联反应基本充分。静置至产物分层，取水相层上方白色乳浊液用异丙醇少量多次洗涤，真空干燥箱中干燥至恒重备用[20，21]。制备流程见图3。图3 熊果苷/HA-ADH微球的制备流程
       2.3 熊果苷/HA-ADH微球的表征
       2.3.1 熊果苷/HA-ADH微球的表观形态观察将熊果苷/HA-ADH微球乳液滴在载玻片上成单层，自然烘干，400×镜下和1000×油镜下观察微球形态并拍照。
       2.3.2 红外光谱分析将干燥的熊果苷原粉、HA-ADH空白微球及熊果苷/HA-ADH微球研磨成粉末，通过KBr压片法制成薄片，用傅立叶红外光谱仪测定产物的红外图谱，分辨率为4cm-1，扫描16次，进行图谱比较。考察活性组分与聚合物之间的相互作用。
       2.4 载药量和包封率的测定采用酶解法处理样品，按加入乙醇后的酶解体积推算熊果苷浓度测定值。按式①和式②计算微球的载药量(DL%)和包封率(LE%)。微球载药量(%)=微球中药物的质量微球的质量×100%①微球包封率(%)=微球中药物的质量投药总质量×100%②
       2.5 熊果苷/HA-ADH微球的释药性能取负载有活性组分的多孔微球0.5g，用适量pH=7.3的PBS缓冲液分散后，采用TP2A型智能透皮仪测定载药微球释放的活性物浓度。弃去每次取出的溶液，然后向接收池中补充等量的新鲜磷酸盐缓冲液，以维持接收介质的体积不变。活性物的释放持续10 h，按时间间隔和累积释放百分比得到活性物的释放曲线。按式③计算累积释放率：累积释放率(%)=(∑ni=1V×Ci/W)×100%③式中Ci为释放介质中活性物的浓度(mg/ml)，V为每次取样的体积，针对本文为10 ml，W为总的载药量(mg)。
       3 结果与讨论
       3.1 熊果苷/HA-ADH微球的表征
       3.1.1 熊果苷/HA-ADH微球的表观形态观察部分光镜和油镜下的微球形态显微照片如图4所示。A-光镜，400× B-油镜，1 000×图4 熊果苷/HA-ADH微球经干燥后显微镜照片光镜及油镜下可见，熊果苷/HA-ADH微球成球性和分散性好，干燥后可达纳米级。
       3.1.2 红外光谱分析图5分别为熊果苷与空白HA-ADH微球、吸附后HA-ADH微球的红外谱图，发现吸附后的微球上均没有明显的新峰出现，说明活性物在微球上的吸附主要为物理吸附。图5 熊果苷、空白微球及载药微球红外光谱分析图空白及吸附后的HA-ADH微球在吸收频率为1 690 cm-1和1 600 cm-1处有强吸收峰，说明生成了-CO-NR2的结构，标志着交联反应的发生。
       3.2 熊果苷标准曲线本方法采用酶解法尽量降低HA的分子量，使其中的熊果苷充分释放，再用乙醇沉淀糖类物质，离心后的清液中没有糖类物质，对紫外分光光度计的药物吸收测量没有影响。经测定，熊果苷最大吸收波长为λmax=280 nm。绘制熊果苷标准曲线，回归方程为：Y=0.088 95+6.34 368X，Y为吸光度，X为熊果苷浓度(μg/ml)。在吸光度Y=0.197～1.295之间，相关系数R=0.998 76。
       3.3 载药量和包封率的测定结果经测定，本方法制备的载药微球载药量(DL%)为(8.33±1.52)%，包封率(LE)%为(67.37±1.64)%(n=5)。熊果苷为水溶性功效物质，在微球制备过程中以包埋机制与HA-ADH微球结合。当超声波将HA和熊果苷的溶液(水相)乳化后，由于ADH对HA发生的是缓慢交联，微球中的熊果苷仍处于被物理包埋与游离于乳液中不断变换的动态环境。在这个过程中，粒径小的微球比表面积大，能接触更多的熊果苷分子，从而使包埋效率提高。而粒径大的微球包埋率则相对较低。熊果苷分子一旦被HA包埋，由于ADH的交联作用，HA的粒径处在一直收缩的过程中，孔隙变小，又会对ADH的包埋起到紧实的作用。因此，对多个微球而言，熊果苷游离出HA微球中的量总是小于HA微球在同一时刻对其包埋的量。
       3.4 熊果苷/HA-ADH的释药性能
       3.4.1 熊果苷/HA-ADH微球的突释和缓释效应图6～9为熊果苷/HA-ADH微球不同情况下累积释药率随时间的变化关系。熊果苷是极性较强的物质，且与水的亲和能力强，在水中的溶解度很大。从图中可以看出，载药微球中熊果苷的释药速率明显低于自然熊果苷的溶解速率，达到了缓释的效果。另外，载药微球中的熊果苷，均存在刚开始“突释”，随后匀速释放的现象。“突释”是吸附在微球表面的熊果苷向介质中快速扩散的结果。释药过程中熊果苷/HA-ADH发生显著溶胀，凝胶骨架变得疏松，为内部药物释放提供通道。此时由于释药空间的增大，药物量的减少，释放速率将变慢。 最后，HA-ADH在水中分散成絮状物质，悬浮在水中，并不溶解。
       3.4.2 载药微球性能对释放行为的影响在活性物释放的过程中，通常是微球中被吸附的活性物首先经过水溶解，之后溶解的活性物由于浓度梯度的存在而扩散到接受介质中。对于熊果苷来说，它在水中的溶解度很大，因此它的释放主要受扩散控制。
       在负载量一定的情况下，研究不同的微球粒径对熊果苷释放性能的影响，结果如图6所示。可以看出，随着微球粒径的减小，载有活性物的微球体外释放的速率和最终的平衡释放率均增加。不同孔径对负载熊果苷多孔聚合物微球的累积释放百分率的影响见图7。对于多孔的聚合物载体来说，孔径是被负载活性物扩散释放的通道。实验结果显示，孔径越大，释放速度越快。图6 微球粒径对熊果苷释放性能的影响图7 微球孔径对熊果苷释放性能的影响图8 不同负载量对熊果苷释放性能的影响图9 不同温度对熊果苷释放性能的影响
       3.4.3 负载量对释放行为的影响在其它条件相同的情况下，改变活性物熊果苷的添加量，制备了负载量分别为20%，35%和50%的多孔聚合物微球，考察其体外释放行为，并与自然熊果苷(原粉)进行对照，结果如图8所示。可以看出，载药微球负载量越低，其突释现象更为明显，第2小时时已可释放载药总量的42%，突释量占总释放量的45%以上。其原因可能在于熊果苷是极性较强的物质，与水有较好的亲和力，再加上熊果苷在释放介质中的溶解度较大，导致释放速率较快。总的来看，载药量高的微球具有更长的缓释时间。
       3.4.4 温度对释放行为的影响在负载量一定的情况下，在25～37℃范围内研究温度对熊果苷体外释放行为的影响，结果如图9所示。可以看出，温度对熊果苷的释放行为稍有影响，温度越高，释放率越高。这是因为较高的温度有利于分子的扩散。
       4 结论
       本实验采用超声乳化法选择油包水W/O乳液体系，以熊果苷为被包裹功效成分，成功制备了熊果苷/HA-ADH微球，成球性和分散性良好。微球载药量(DL%)为(8.33±1.52)%，包封率LE%为(67.37±1.64)%(n=5)。实验还对所制得的载药多孔微球的体外释放行为进行了研究。结果表明，熊果苷/HA-ADH微球对其有较好的缓释作用。微球粒径较大和负载量高时具有较好的缓释效果，孔径对其释放行为也有一定影响，孔径大的具有更快的释放速度;释放介质温度的变化对其释放行为影响较小。
       与传统的化妆品配方相比，将多孔聚合物微球系统应用于化妆品中，可以将其中的活性组分缓慢释放到皮肤表面，以达到长时间维持有效浓度、降低毒副作用等目的。另外，多孔聚合物微球的透气性和保湿性，使它能够很好的与皮肤相容。研究微球结构、活性物性质和释放性能的基本规律对于指导化妆品用功效原料的制备，开发适合的透皮吸收缓释载体具有指导意义。
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