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       【摘要】 
       目的研究大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI) 在体外对人肺癌PG细胞生长抑制作用和对细胞周期的影响。方法采用MTT法检测SBTI对人肺癌PG细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测SBTI对人肺癌PG细胞周期的影响；电子显微镜观察SBTI对细胞调亡的作用。结果SBTI对人肺癌PG细胞的生长有明显抑制作用；SBTI可以将人肺癌PG细胞阻滞于S期；SBTI可以促使人肺癌PG细胞出现明显的染色质浓缩和凋亡小体，诱导人肺癌PG细胞的凋亡。结论大豆胰蛋白酶抑制剂能抑制人肺癌PG细胞生长、诱导人肺癌PG细胞调亡的作用，其作用的机制为阻滞人肺癌PG细胞于S期，促使人肺癌PG细胞出现明显的染色质浓缩和凋亡小体，实验为大豆胰蛋白酶抑制剂抗肿瘤效应提供了实验依据。
       【关键词】  大豆胰蛋白酶抑制剂； 人肺癌PG细胞； 生长抑制； 细胞周期
       大豆胰蛋白酶抑制剂 (Soybean trypsin inhibitor，SBTI) 是从大豆中提取的，含有71个氨基酸残基的糖蛋白，能够抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等相关的蛋白酶的特异作用［1］。大豆胰蛋白酶抑制剂具有多种药理活性， 主要包括抗肿瘤、抗病毒、抗炎等。在对结肠癌、 前列腺癌、 乳腺癌等的研究中，发现大豆胰蛋白酶抑制剂有明显的抗肿瘤作用［2］，已经受到人们的广泛关注， 成为新的医学研究热点。本研究观察了SBTI对肺癌细胞PG增殖、细胞周期、细胞凋亡长的影响， 进一步探讨SBTI的抗肿瘤作用，为SBTI的临床用药积累实验资料，提供科学依据，为大豆胰蛋白酶抑制剂更深入的开发利用提供实验基础。
       1  材料
       1.1  细胞株与药物人肺癌PG细胞为北京中医药大学东方医院细胞培养室保存。大豆胰蛋白酶抑制剂为Sigma公司产品。
       1.2  试剂与仪器DMEM培养液 （Invitrogen  Corporation），胎牛血清（Sigma公司），胰酶（Gibio公司），塞唑蓝 (MTT，北京拜尔迪生物科技有限公司) ，FIT-Annexin V/PI 凋亡试剂盒（Biovision公司）。CO2培养箱（德国Binder公司），BDS200倒置显微镜（重庆奥特仪器有限公司），XI81倒置荧光显微镜（日本，奥林巴斯公司）激光共聚焦扫描显微镜，电镜（日本 奥林巴斯公司），BD Facscalibur 流式细胞仪（美国 BD公司）。
       2  方法
       2.1  细胞生长抑制实验肿瘤细胞培养。人肺癌PG细胞使用含有10%热灭活胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的RPMI 1640全培养液， 置37 ℃，5 %CO2 的培养箱培养，隔天换液，细胞可贴壁生长,用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液分散细胞进行传代培养。
       
       采用MTT法测定细胞生长。取对数生长期细胞，在96孔培养板中接种细胞，每孔加含2×104个/ml细胞的培养液100 μl，在37 ℃, 5 %CO2 的培养箱中预培养24 h，加各浓度的SBTI，使终浓度分别为0，0.5，1.0，2.5，5.0 mg/L，每个浓度均设6个复孔，以加有药液和培养液，不加细胞的为空白对照，以含同一细胞密度的培养液为细胞对照组，分别培养24，36，48 h后，每孔加入20 μl MTT(5mg/ml)，37℃继续孵育4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，以空白组调零，应用酶标仪于492 nm处测定各浓度组、细胞对照组吸收度(A)值，计算细胞死亡率，求取半数抑制浓度(IC50)。求每次测定的6孔的平均值，实验重复3次。抑制率以下列公式计算。
        　
       抑制率(%)=（1-样品孔A/对照孔A）×100%
       
       IC50统计方法:采用最小二乘法求回归方程，根据回归方程求IC50。
       2.2  细胞周期的观察取不同浓度SBTI（0，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 mg/L）分别作用于对数生长期肺癌PG细胞48 h后，收集贴壁及已悬浮的细胞，1 200 r/min离心10 min，PBS洗1次，70%冰乙醇-20℃固定18 h，PBS洗2次，DNA REAGEND KIT进行染色，用流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化，得出细胞群体在细胞G0/G1、S、G2/M期的分布比例。
       2.3  细胞形态学观察透射电镜观察：取对数生长期细胞与不同浓度的SBTI共同培养24，48 h，消化，2 000 r/min离心5 min收集细胞，细胞沉淀用2.5%戊二醛进行前固定，锇酸后固定，并按常规方法逐级脱水、EPON812包埋、超薄切片、枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重染色，电子显微镜下观察细胞超微结构变化。
       2.4  统计学处理所有实验数据用±s表示，用SPSS11.0进行统计分析，组间差异采用两样本均数比较的t检验。
       3  结果
       3.1  SBTI对肺癌PG细胞生长的抑制作用SBTI对肺癌PG细胞的生长具有明显的抑制作用。时间延长、药物浓度增加，抑制作用增强。同一浓度药物作用时间越长，细胞的生长抑制率越高，同一作用时间，药物浓度高的细胞生长抑制率相对高于药物浓度低的细胞生长抑制率，但差别无显著性。肺癌PG细胞经SBTI  1.0 mg/L作用24 h，细胞生长抑制率为（61.39±3.92）%  ，作用48 h后，细胞生长抑制率为（74.03±4.68）%，SBTI作用时间延长，对肺癌PG细胞生长抑制的半数抑制浓度明显下降，其中24 h的IC50为1.84 mg/L，36 h的IC50为1.34 mg/L，48 h的IC50为1.20 mg/L。结果见图1。
       
       3.2  SBTI对肺癌PG细胞生长周期的影响0.5 mg/L SBTI作用肺癌PG细胞48 h后，S期细胞比例为33.00%，与对照组比较无明显差异，1.0 mg/L SBTI作用肺癌PG细胞48 h后，S期细胞比例为36.18%，2.5 mg/L SBTI作用肺癌PG细胞48 h后，S期细胞比例为38.91%，5.0 mg/L SBTI作用肺癌PG细胞48 h后，S期细胞比例为41.60%，10.0 mg/L SBTI作用肺癌PG细胞48 h后，S期细胞比例为53.72% 。SBTI作用肺癌PG细胞48 h后， S期细胞比例明显增加，G2/M期细胞比例相应减少，表明浓度大于2.5 mg/L的SBTI能够阻滞肺癌PG细胞于S期。见图2。
       3.3  SBTI对细胞超微结构的改变SBTI作用肺癌PG细胞24 h，细胞膜表面绒毛减少，SBTI作用肺癌PG细胞36 h，细胞膜表面绒毛基本消失，并可见凋亡小体，核染色质边呈新月形聚集于核膜下，SBTI作用肺癌PG细胞48 h，新月形空泡结构增多（图3）。
       4  讨论
          
       本研究在体外实验中观察到SBTI可抑制人肺癌PG细胞的生长。MTT法测得其在体外作用48 h的IC50为1.20 mg/L。
       
       现代研究表明，细胞周期的调控异常导致细胞的失控性增殖，是肿瘤发生和发展的重要特征，几乎所有的肿瘤都有细胞周期调控机制破坏，导致细胞生长失控、分化受阻、凋亡异常的特征［3］。目前诱导或者促进肿瘤细胞凋亡、引起肿瘤细胞周期阻滞正成为肿瘤预防和治疗研究的新思路。采用流式细胞仪观察了不同浓度SBTI作用于人肺癌PG细胞24，36，48 h后，对其细胞周期分布的影响。结果表明，SBTI使细胞各时相都有所抑制，同时使G2/M期细胞的比例减少，S期细胞的比例增加，且呈明显的剂量依赖性，表明SBTI对S期细胞向G2/M期移行有一定的阻断作用。S期延长意味着细胞增殖周期延长，增殖缓慢；S期细胞增多有两种发展方向：或者在一定条件下恢复到增殖状态；或者丧失增殖能力，发生凋亡以及经分化、衰老直至死亡。在各个时间点内，我们发现在S期细胞比例增多的同时伴随有G2/M期细胞比例减少的趋势，这提示SBTI能明显抑制细胞周期的转换。说明细胞群被阻滞在S期，没有进入G2/M期，进而出现凋亡。细胞周期的阻滞先于细胞凋亡的发生，细胞周期的阻滞抑制了细胞增生，SBTI诱导细胞凋亡主要是S期的细胞。
       本研究通过超微结构变化观测到SBTI作用人肺癌PG细胞后，呈现出细胞体积缩小、细胞质浓缩、核变小、核染色质浓缩及偏位、细胞质内空泡和凋亡小体出现等典型的凋亡现象。
       
       综上所述，SBTI对人肺癌PG细胞具有一定的生长抑制活性，能改变细胞周期，促进肿瘤细胞的凋亡。有关SBTI改变细胞周期诱导细胞凋亡的作用机制，特别是SBTI作为蛋白酶抑制剂能否抑制高转移性细胞株人肺癌PG细胞的转移，还有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］杨志宏，周 三，关崎春雄，等.山东产野生大豆胰蛋白酶抑制剂的初步研究［J］. 西北植物学报，2009，29(8):1562.
       
       ［2］Kobayashi H，Suzuki M．Kanayama N，et al.Z．A soybean Kunitz trypsin inhibitor suppresses ovarian cancer cell invasion by blocking urokinase upregulation［J］.Clin.Exp.Metastasis， 2004，21(2):159.
       
       ［3］邹向阳，李连宏.细胞周期调控与肿瘤［J］.国际遗传学杂志，2006，29(1):70.