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       【摘要】 
       目的观察丹芪合剂和依那普利对糖尿病大鼠肾小管HGF和SnoN表达的影响。方法SD大鼠随机分为4组：正常对照组（N组），糖尿病组（D组），中药丹芪合剂治疗组（Y组），依那普利治疗组（E组）。采用链脲佐菌素尾静脉注射（55 mg/kg）的方法复制糖尿病模型。生化方法测血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、胆固醇，并计算肾脏指数。HE染色光镜检查肾组织形态学变化。免疫组化观察大鼠肾脏SnoN、HGF、TGF-β1、FN蛋白表达情况，Western blotting检测大鼠肾脏SnoN、HGF、TGF-β1蛋白的表达。结果①D组肾脏指数、血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、胆固醇较N组明显升高；Y组和E组与D组大鼠相比，血肌酐、24 h尿蛋白量及甘油三酯显著降低。②D组大鼠出现明显的肾脏形态学改变，Y组和E组明显改善。③免疫组化和Western blotting结果显示：D组大鼠SnoN和HGF较N组明显降低，Y组和E组明显高于D组；D组TGF-β1和FN明显高于N组，Y组和E组则较D组明显下降。结论丹芪合剂和依那普利可能通过促进HGF生成，从而抑制TGF-β1的产生，以及促进SnoN表达进而抑制TGF-β1/Smad信号通路，使糖尿病肾病得到改善。
       【关键词】  糖尿病肾病； 肝细胞生长因子； SnoN； 丹芪合剂； 依那普利
       糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetic mellitus, DM）最常见的严重并发症之一 ，发病机制复杂，治疗也很困难，最终发展为终末期肾衰竭（ESRD），严重威胁人类健康。转化生长因子β1（transforming growth factor beta1, TGF-β1）是目前公认的与肾脏肥大和肾间质纤维化密切相关的细胞因子，通过下游Smads通路发挥作用。近年来研究发现［1］，转录共抑制因子SnoN是TGF-β1/Smad信号通路重要的负性调节因子，它可与Smads蛋白相互作用，抑制TGF-β1靶基因的活化，从而调控TGF-β1的生物效应。我们近期的研究表明［2］，DN时SnoN蛋白的表达明显降低，对TGF-β1/Smad信号通路的负调控作用减弱，从而促进DN的发生发展。据报道［3］，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）为内源性的肾脏保护因子，在肾小管上皮细胞中可介导SnoN生成，从而抑制TGF-β1/Smad信号通路，减缓肾纤维化进展。我们以往的研究表明［4，5］，丹芪合剂和依那普利对肾纤维化有一定的治疗作用，但其作用机制未充分阐明。本研究旨在观察丹芪合剂和依那普利是否通过调节肾小管HGF、SnoN的表达而起到改善DN的作用。      
       1  材料与仪器
       1.1  药物和试剂链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购自Sigma公司；血糖、肌酐、甘油三酯、胆固醇检测试剂盒购自迈克公司，尿蛋白检测试剂盒购自南京建成公司；兔抗鼠SnoN多克隆抗体购自SantaCruy公司；兔抗鼠HGF、TGF-β1和FN多克隆抗体，β-acting单克隆抗体，免疫组化SABC试剂盒，辣根过氧化物酶标记的二抗，ECM显色试剂盒均购自武汉bostor公司，DAB显色剂，SP试剂盒购自北京中杉金桥公司；Western印迹所用PVDF膜、3 mm Whatman滤纸购于美国milli-pore公司；依那普利，扬子江制药厂生产；丹芪合剂为丹参、黄芪、生地黄等中药的自制提取液。
       1.2  器材美国强生血糖仪；高速低温离心机（Beckman公司）；核酸蛋白分析仪（Amersham公司）；电泳系统及电转移装置（Amersham公司）；凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司）。
       2  方法
       2.1  动物及分组雄性SD大鼠48只，体质量180～220 g，购于上海实验动物中心。随机分为4组，每组12只：正常对照组(N组)、糖尿病组(D组)、糖尿病丹芪合剂治疗组(Y组)和糖尿病依那普利组(E组)。用0.1 mmol/L，pH 4.0 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将链脲佐菌素(STZ)配成5%的溶液，D组、Y组、E组按55mg/kg的剂量单次尾静脉注射，N组大鼠尾静脉注射0.2 ml等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。48h后尾静脉采血测量空腹血糖值，大于或等于16.7者为糖尿病大鼠模型。除N组外所有动物全部成模。各组大鼠均喂食颗粒饲料，自由饮自来水，成模第2日起，Y组大鼠给予丹芪合剂灌胃1.8 g/（kg·d），E组大鼠依那普利灌胃2 mg/（kg·d），N组和D组大鼠1.5 ml自来水灌胃。
       2.2  血、尿及肾脏标本的采集大鼠饲养12周后处死，处死前称体质量，代谢笼收集24 h尿量并计量，-20℃保存。股动脉取血，离心分离血清，-20℃保存。空腹8 h后处死动物，生理盐水充分灌洗肾脏，滤纸吸干后称重，一侧肾固定于4%多聚甲醛中供石蜡切片用，另一侧肾脏于-80℃保存供Western blotting检测用。
       2.3  肾脏指数及生化检测肾重与体重之比为肾脏指数（kidney index，KI）；氧化酶法测血糖（blood glucose，BG）；考马斯亮蓝法测尿蛋白浓度，乘以24 h尿量即24 h尿蛋白量(24 h urine protein，24 hUP)；碱性苦味酸法测血肌酐(serum creatinine, SCr)；超微量酶法检测总胆固醇(cholesterol，Ch)；GPO-PAP法检测甘油三酯(triglyceride, TC)。
       2.4  肾组织形态学观察多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，HE染色后光镜观察肾组织形态学变化。
       2.5  免疫组化法观察多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，用免疫组化SP法检测各组大鼠肾皮质中SnoN和HGF表达，一抗浓度分别为1∶100、1∶200，用SABC法检测各组大鼠肾皮质中TGF-β1和FN，一抗浓度为1∶100、1∶50，阴性对照用PBS代替一抗。DAB显色，苏木素复染。SnoN、HGF、TGF-β1在高倍镜（400×）下随机计数10个不重复视野，对染成棕黄色的肾小管数进行统计，取均值；FN在显微镜测微尺（0.5网形目镜尺）下随机计数十字交叉点与FN阳性染色表达重合的点数，计数10个视野（400×），取均值。
       2.6  Western blotting 检测-80℃保存的各组大鼠肾皮质，每组100 mg，蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法定量。蛋白质样品经12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上，SnoN、HGF、TGF-β1、β-actin一抗工作浓度分别为1∶200，1∶400，1∶200，1∶300，凝胶成像系统扫描成像，Quantity one图像分析，SnoN、HGF、TGF-β1与同一张胶相应的β-actin条带所测积分灰度值的比值，即相对积分灰度值。
       2.7  数据分析所有数据以±s表示，采用SPSS11.5软件分析，组间数据差异比较采用单因素方差齐性检验，用One-way ANOVA分析，P<0.05为显著差异。
       3  结果
       3.1  肾脏指数及各生化指标变化D组较N组大鼠，肾脏指数、血糖、24 h尿蛋白量、血肌酐、胆固醇、甘油三酯均明显升高（P＜0.01）。Y组和E组，尿蛋白、血肌酐及甘油三酯显著降低（P＜0.05），但血糖和肾脏指数无明显改善。结果见表1。表1  各组大鼠的肾脏指数、血糖浓度、24h尿蛋白量、血肌酐、胆固醇、甘油三酯水平(略)
       3.2  肾组织形态学变化HE染色可见，正常组大鼠肾脏肾小球形态完整、轮廓清晰，肾小管未见异常。糖尿病大鼠肾小球增大，系膜区基质沉积增多，肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性及基底膜增厚。经丹芪合剂和依那普利治疗后，形态明显改善。
       3.3  免疫组化结果N组肾小管上皮细胞有较多HGF表达，D组表达减少，Y组和E组表达较D组明显增加；肾小管上皮细胞SnoN表达D组较N组明显减少，Y组和E组较D组表达明显增加；TGF-β1在N组几乎无表达，D组肾小管上皮细胞有较多表达，Y组和E组明显降低；FN沿肾小管基膜表达，N组表达较少，D组表达明显增加，治疗组较D组显著降低。各指标在两治疗组之间无统计学差异。结果见图1和表2。表2  各组大鼠肾组织中HGF、SnoN、TGF-β1、FN蛋白表达的情况(略)
       3.4  Western blotting 结果HGF蛋白N组大鼠表达较多，HGF与β-actin的积分灰度值之比为（0.86±0.16），D组下降明显，为N组的61.6%（0.53±0.08），Y组和E组明显增高，分别为N组的91.9%和89.8%（0.79±0.07，0.77±0.11）；SnoN蛋白N组大鼠表达较多，SnoN与β-actin的积分灰度值之比为1.19±0.12，D组下降明显，为N组的66.3%（0.79±0.09），Y组和E组明显升高，为N组的89.9%和89.8%（1.07±0.05，1.06±0.16）；TGF-β1蛋白N组大鼠表达较少为（0.05±0.01），D组为0.70±0.12，Y组和E组为D组的55.7%和54.3%（0.39±0.06，0.38±0.04）。结果见图2。
       4  讨论
          
       本研究用STZ诱发糖尿病大鼠模型，动物在注射STZ后48 h血糖明显升高，整个实验过程中血糖持续在高水平，大鼠出现多饮、多食、多尿现象，同时出现了肾脏损害，细胞外基质成分FN沉积显著增多，即发生了DN并且有肾脏纤维化改变。经自研中药丹芪合剂和血管紧张素转化酶抑制剂依那普利治疗，显著降低了糖尿病大鼠的尿蛋白、血肌酐及甘油三酯，并且肾脏组织形态得以一定程度改善，FN沉积也明显减少。表明我们自研中药丹芪合剂和依那普利均有改善糖尿病大鼠肾功能、脂质代谢并减轻肾脏病理改变，减少细胞外基质沉积，延缓DN进程的作用。与我们以往的研究结果一致［4,5］。
         
       尽管DN的发生发展是由多种因素决定的，但是TGF-β1作为一种关键的细胞因子，在DN的发展过程中具有重要作用。大量研究表明［3］，TGF-β1可以刺激肾脏间质成纤维细胞和肾小球系膜细胞向肌成纤维细胞转化，诱导肾小管上皮细胞向间质细胞的转分化，促进细胞外基质成分的合成并抑制其降解，导致细胞外基质过度累积，造成肾组织纤维化。TGF-β1的这些作用都是通过膜受体激活细胞浆中的Smad蛋白，转移至核内而发挥作用。本研究结果也显示，D组TGF-β1和FN的表达明显高于正常对照组。
       
       另有研究表明［6～8］，糖尿病状态时血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）产生增加，肾脏对AngⅡ的敏感性也升高，AngⅡ可以抑制肝细胞生长因子HGF的表达。本研究结果也显示，DN时HGF明显减少，用血管紧张素转化酶抑制剂依那普利显著抑制AngⅡ的产生，所以E组HGF明显增加。
       
       HGF是对糖尿病肾病有保护作用，有文献报道［6］，HGF基因的5ˊ端驱动子序列中存在有TGF-β1抑制元件，抑制TGF-β1的表达，HGF可能通过抑制TGF-β1的产生而发挥其肾脏保护作用。本研究也显示E组大鼠TGF-β1明显减少。另有学者报道［9］，在肾小管上皮细胞内HGF可以通过ERK1/2和SP1途径增加Smad转录共抑制因子SnoN的mRNA水平使SnoN蛋白产生增加。SnoN为TGF-β1/Smad通路重要的负调节因子，它可以在胞浆和胞核水平与TGF-β1下游的Smads蛋白相互作用使其失活，抑制TGF-β1靶基因的活化，阻断其生物学效应。有学者在单侧输尿管梗阻（UUO）所致的大鼠肾纤维化模型中研究发现［9］，SnoN减少对肾纤维化的进展起着重要作用，我们以往对DN模型的研究中也发现［2］，DN时SnoN表达明显减少，说明SnoN的减少在DN的发生发展中也起着重要的作用。本研究显示，D组SnoN表达明显减少，与以往的研究结果相一致，依那普利治疗后，SnoN蛋白随着HGF的增加也明显增加，并且肾脏损害明显减轻。所以，依那普利治疗DN可能是通过增加肾小管上皮细胞HGF的表达，一方面HGF抑制TGF-β1的产生，另一方面，HGF使SnoN表达增加，而阻断TGF-β1/Smad通路，使FN沉积减少，抑制DN的发展，改善肾功能。
       
       丹芪合剂是由丹参、黄芪、生地黄等中药提取物组成，具有益气生津、活血化瘀的功效。本课题组以往的研究就表明，丹芪合剂治疗后，TGF-β1的表达明显减少，其减少的机制是否与HGF和SnoN的调节有关尚不清楚。本研究结果显示，丹芪合剂治疗后，HGF表达明显增加，并且TGF-β1减少，说明丹芪合剂有可能是通过增加HGF的表达，抑制TGF-β1的产生，以及HGF促进SnoN表达进而抑制TGF-β1/Smad信号通路，从而改善糖尿病肾病。
       
       丹芪合剂和依那普利通过提高HGF和SnoN蛋白的表达，改善糖尿病肾病。提高内源性的HGF和SnoN可能为临床治疗提供新的作用靶点。
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