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       【摘要】 
       目的研究地鳖虫纤溶活性先导蛋白（EFP）对荷S180和H22小鼠肿瘤的抑制作用。方法通过体外实验，构建荷瘤小鼠模型，药物实验分为阳性对照组（环磷酰胺），阴性对照组（生理盐水），药物高浓度组、中浓度组和低浓度组。实体瘤通过瘤重计算抑瘤率，腹水瘤通过细胞浓度计算抑瘤率。结果EFP对S180腹水瘤有较好的抑制率， 药剂量为2.90mg/kg的抑制率为69.56%，明显高于环磷酰胺(20mg/kg)的51.75%的抑制率；EFP对S180实体瘤有较好抑制作用，药剂浓度为1.45 g/kg时，抑制率为37.48%，高于环磷酰胺(20 mg/kg)的35.59%的抑制率，并呈现一定的药物剂量依赖性；药剂浓度为0.73 mg/kg时，对H22实体瘤抑瘤率为41%，高于环磷酰胺(20 mg/kg)的37%的抑制率。结论EFP对荷S180和H22小鼠肿瘤有较好的抑制作用。
       【关键词】  地鳖虫纤溶活性先导蛋白； S180细胞； H22细胞； 抑瘤作用
       The Antitumour Effect of  Eupolyphaga Fibrinolyric Protein on S180 and H22 in vivo
       LIU Hao, HAN Yali, DING Hong, LI Ziwei
       (Faculty of Light and Chemical Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006, China; Department of Biology,Jieyang College,Jieyang 522000, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the antitumor effect of Eupolyphaga fibrinolyric protein on S180 and H22 in vivo. MethodsTumor-bearing mouse model was built in vivo, and the experiments were divided into positive control group (cyclophosphamide), negative control group (saline), the high concentration drug group, the middle concentration drug of group,  the low concentration of drug group .The inhibition rate against ascites tumor was calculated by the tumer weights and the rate anainst solid tumor was calculated by the concentration of cells．ResultsEFP had significant inhibition against S180 ascites tumor, when the dose of drug was 2.90 mg/kg, the inhibition rate was 69.56%, higher than that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (51.75%). EFP had preferably inhibition against S180 solid tumors, when the dose of drug was 1.45 mg/kg, the inhibition rate was 37.48%, higher than that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (35.59%), and a certain dose-dependent .When the drug concentration was 0.73 mg/kg, the H22 solid tumor inhibition rate was 41%, higher than that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (37%).ConclusionEFP has obvious antitumor effect on S180 and H22 in vivo.
       Key words：Eupolyphaga fibrinolyric protein；  S180 cell line；  H22 cell line；  Antineoplastic activity
         
       药用地鳖在祖国医学中是一味重要的活血化瘀药材，具有破淤血、续筋骨、消肿止痛等药用功效［1］，临床主要用于淤血阻滞,癥瘕积聚,跌扑损伤等症。中医处方亦用其治疗肿瘤，目前将其用于治疗消化道肿瘤的较为普遍［2］。本实验室在进行中药抑瘤活性成分研究中,以地鳖虫Eupolyphaga sinensis Walker为材料，分离纯化到一组纤溶活性蛋白（fibrinolytic proteins from Eupolyphaga sinensis, EFP），并发现该活性蛋白对部分肿瘤细胞有显著的细胞毒性作用［3］。本文在建立了H22和S180荷瘤小鼠的基础上，检测了EFP提取物对该荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用, 旨在探讨EFP的抑瘤作用,为地鳖抗肿瘤活性有效成分的进一步纯化和作用机制的研究奠定基础。
       1  材料
       1.1  药物地鳖蛋白以韩雅莉等［4］方法制备，将冻存地鳖（-80℃）置4℃解冻，称重，按1∶1(V/V)与预冷0.01 mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)混和匀浆，再按1∶5加入该缓冲液，静置抽提（4℃，12 h），离心（4℃，8 000 r/min，15 min），弃沉淀，上清中加入适量硫酸铵，以盐析法提取蛋白质，收集饱和度35%～70%的盐析组分（蛋白），蒸馏水透析除盐，过DEAE-纤维素阴离子柱，分段收集洗脱蛋白组分，以纤溶平板检测各管液体的纤溶活性，合并具纤溶活性各管液体，真空冷冻干燥成粉末，置-20℃保存备用。环磷酰胺（CTX），山西普德药业有限公司。
       1.2  动物与细胞清洁级KM小鼠，体质量（20±2）g，雌雄各半，由广州中医药大学实验动物中心提供。小鼠肉瘤细胞株（S180），由广东省第二中医院研究所提供；小鼠肝癌H22，由广州生物医药与健康研究所提供。
       1.3  试剂RPMI 1640培养基,北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司；小牛血清, Hyclone，新西兰PERBIO SCIENCE 公司 ；胰蛋白酶，北京鼎国生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO），美国AMRESCOO公司产品；环磷酰胺（CTX），山西普德药业有限公司。
       2  方法
       2.1  纤溶活性的测定参照文献［5］的方法,制备纤维蛋白平板,在平板上打孔(直径7.0 mm),加入待测样品，对照孔加0.01 mol/L 20 μl缓冲液,置37℃保温至溶圈清晰可辨，约24 h, 考马斯亮蓝R250染色后，脱色液脱色后观察，测量溶圈两垂直直径,以UK为标准品, 检测地鳖纤溶活性蛋白的纤溶活性。以考马斯亮蓝法和蒽酮法测定冻干蛋白中糖含量和蛋白含量。
       2.2  S180腹水瘤与实体瘤实验将冻存S180肿瘤细胞于37℃ 1 min内复苏，1 000 r/min离心5 min，去上清，以RPMI1640含15%小牛血清培养液培养细胞生长至对数期，1 000 r/min离心5min，适量生理盐水稀释瘤细胞悬液,细胞数为107 /ml, 取3只正常小鼠，每鼠腹腔注入0.2 ml腹水瘤细胞悬液, 制备恶性腹水瘤小鼠模型。10d后，选取生长良好的S180荷瘤小鼠(腹水型), 无菌条件下抽取腹水，以生理盐水1∶1稀释制成瘤细胞悬液，每鼠腹腔注入0.2ml使之形成腹水型荷瘤状态；将另40只小鼠,每鼠左侧腋窝皮下接种0.2 ml瘤细胞悬液（约含瘤细胞106), 使之形成恶性实体瘤荷瘤状态，每日观察记录。
       
       接种翌日小鼠腹腔注射药物，将40只S180腹水瘤小鼠随机分5组（8只/组），阳性对照组注射20 mg/kg环磷酰胺，阴性对照注射0.2 ml生理盐水、药物高剂量组注射1.45 mg/kg，中剂量组注射0.725 mg/kg，低剂量组注射0.363 mg/kg（EFP药物剂量均参照本室EFP治疗S180荷瘤小鼠的最佳剂量），均为1次/d，连续8 d。同样，接种实体瘤24 h后对小鼠进行腹腔注射药物处理，将40只S180荷瘤小鼠随机分5组（8只/组），分组情况与注射药物均与腹水瘤小鼠相同，均为1次/d，连续处理9 d。
       2.3  H22荷瘤小鼠模型建立及药物处理将冻存H22肿瘤细胞与上述相同方法复苏、培养、制备H22腹水瘤小鼠模型，抽取H22荷瘤小鼠(腹水型)腹水制成瘤细胞悬液，取其0.2 ml注入无瘤小鼠右侧腋窝下使之形成恶性实体瘤荷瘤状态。24 h后,对其进行腹腔注射药物处理，将40只小鼠随机分5组（每组8只），阳性对照组，每只小鼠腹腔注射环磷酰胺20 mg/kg,阴性对照组小鼠腹腔注射0.2 ml生理盐水，药物处理组药物剂量均参照本室EFP治疗S180荷瘤小鼠的最佳剂量，药物高剂量组每日注射1.81 mg/kg,中剂量组每日注射1.45 mg/kg,和低剂量组每日注射0.725 mg/kg，均为1次/d，连续处理7 d。
       
       对上述实验各组均于每次给药后测量小鼠体质量。S180腹水瘤小鼠于最后一次给药24 h后，抽取腹水，测定每只小鼠腹水体积和细胞浓度。S180与H22实体瘤小鼠，均于最后一次给药后24h后取瘤块和脾脏，称重。比较各组脾系数间差异；分析各组动物平均体重变化，依以下公式计算抑瘤率和器官系数。
       
       抑瘤率(％)= (对照组平均细胞浓度-给药组平均细胞浓度)／对照组平均细胞浓度×100％
       抑瘤率(％)= (对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)／对照组平均瘤重×100％
       2.4  统计学处理实验结果采用完全随机设计的方差分析, 组间差异用Excel进行t检验，以α=0.05为检验水准，通过SPSS 11.5数据统计软件计算结果。
       2.5  细胞培养实验
       2.5.1  含药血清制备将25只小鼠分为阳性对照组、阴性对照组、药物高剂量组（2.90 mg/kg）、中剂量组（1.45 mg/kg）和低剂量组（0.73 mg/kg），各组均腹腔给药2次/d，0.2 ml/次, 连续3 d。末次给药前禁食4 h，自由饮水，末次给药后2 h眼球取血，室温静置2 h，分离血清，56℃ 30 min灭活，分别以DMEM和1640不完全培养基稀释至20%血清，220nm滤膜过滤除菌，-20℃冰箱保存备用。
       2.5.2  MTT检测小鼠肝癌H22用含10%胎牛血清、100 U/ ml青霉素和100 U/ ml链霉素的DMEM培养基培养。置37℃,5% CO2饱和湿度的培养箱培养,呈对数生长期细胞用于实验。
       2.5.3  MTT法检测含药血清及EFP对细胞增殖的反应取对数生长的H22细胞，以1×106 ml-1×50 μl/孔的接种量接种于96孔培养板,分别加入浓度为20%的含EFP血清（0.73，1.45，2.9 mg/kg)、环磷酰胺含药血清（20 mg/kg），生理盐水含药血清各50 μL；另一组加入不同浓度的EFP（1，0.5，0.2，0.1，0.05，0 mg/ml）和阳性对照顺铂（50 mg/ml）各50μl，各有5个平行孔，同时设调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），继续培养44 h，加PBS配置除菌的MTT(5 mg/ml)，10 μl／孔，继续培养4 h，离心弃上清，加入DMSO 100 μl／孔，轻振混匀，10 min后酶标仪测定（波长490 nm和630 nm）A值。作组间t检验，依A值按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率:
       
       抑制率（％）=(对照组A值-含药血清组A值)/空白血清组A值×100
       3  结果
       3.1  EFP分离纯化与成分测定地鳖经匀浆、盐析和透析得到EFP粗提物，将其过DEAE-52离子交换纤维素离子交换柱层析分离，经1 mol/L NaCl梯度洗脱，洗脱液经核酸蛋白检测仪检测，出现了2个蛋白峰，其中峰1蛋白含量极低，峰2蛋白含量较高。因而，收集峰2样品。峰2蛋白经SDS-PAGE检测，根据标准蛋白计算EFP的3个蛋白亚基EFP1、EFP2、EFP3，相对分子质量分别为74.9KD，71.5KD，65.2KD。
       
       参照尿激酶标准曲线测得冻干蛋白的纤溶活力为20 U/mg。经蒽酮法和考马斯亮蓝法测定地鳖纤溶蛋白冻干粉中糖含量为82.8%，蛋白质含量为17.2%。
       3.2  EFP对小鼠S180腹水瘤的抑制作用实验结果表明高、中两个EFP剂量组和环磷酰胺均能显著抑制S180腹水的生成，减少瘤细胞数量，高剂量EFP抑瘤率达69.56%；中剂量EFP抑瘤率为30.76%，小鼠的生长状态良好，而低剂量EFP抑瘤效果很差，抑瘤率仅为3.98%。结果见表1。与生理盐水组相比3个EFP处理组瘤细胞数量均明显减少，其中，高剂量组最为显著，中剂量组次之，低剂量组与环磷酰胺组相似。表明EFP对S180腹水瘤抑制效果明显。表1  EFP对S180腹水瘤的抑制作用（略）
       3.3  EFP对小鼠S180、H22实体瘤的抑制作用实验结果表明，高、中、低3个EFP剂量组和环磷酰胺均能抑制S180实体瘤的生长，高剂量EFP抑瘤率为37.48%，中剂量EFP抑瘤率为34.37%，低剂量EFP抑瘤率为25.77%，环磷酰胺抑瘤率35.59%。结果见表2，但该组小鼠体质量和脾重均最小，生理盐水组其次，而EFP 3个药物组体质量和脾增重最高，表明EFP毒性较低。结果见表2。表2  EFP对S180实体瘤的抑制作用（略）
       EFP对H22实体瘤作用结果见表3。高，中，低3个剂量结果来看，低剂量组的抑制率最高，达41%，中剂量组抑瘤率为36%，与环磷酰胺抑瘤率37%相似，高剂量抑瘤效果反而较差，抑瘤率仅为24%。环磷酰胺组小鼠体重和脾重最小，生理盐水组其次，药物组最高。表3  EFP对H22实体瘤的抑制作用（略）
       3.4  EFP含药血清及EFP对细胞增殖的反应不同浓度的EFP含药血清和EFP分别作用于H22细胞株，于48 h采用MTT法检测各组血清对H22细胞株增殖的抑制率（见表4～5）。结果表明，两组EFP含药血清组对H22细胞的增殖均有抑制作用，抑制作用呈一定的量效和时效关系，即随着含药血清浓度的增加，抑制率逐渐增加；而各组EFP对H22细胞的增殖则没有抑制作用，反而对其具有明显促进作用，说明EFP没有细胞毒性。表4  EFP小鼠含药血清对H22细胞抑制作用 （10%），表5  EFP对H22细胞抑制作用（略）。
       4  讨论
         
       目前临床抗癌药物主要为化疗剂，其对肿瘤细胞有直接抑制和杀伤作用，但是，传统的化疗主要着眼于对癌细胞的杀伤，药物存在难以避免的毒副作用，如化疗药物对正常分裂细胞毒性很强，极易造成患者白细胞与血小板减少以及贫血等骨髓抑制症状，成为制约其进一步发展的障碍，再者，肿瘤细胞对化疗剂易产生抗药性，也是导致抗癌治疗失败的主要原因之一。近年来,研究发现中草药无论在抑制肿瘤细胞,还是在肿瘤的病后调理、改善体征、减轻放、化疗不良反应等方面均发挥了重要作用［6］。临床实践证明一些复方的覆盖面较广，但是作用较弱；而一些单味中药定向作用于某些肿瘤，且抑瘤效果显著［7］。
         
       地鳖为我国传统中药，具有显著活血化瘀与抑瘤功效,但其纤溶作用与抑癌作用有何内在相互联系,目前尚未见有关报道，本实验从地鳖中分离纯化得到的纤溶活性蛋白(EFP)，前期实验已证明其具显著抑制血管生成的作用［8］。 通过本文实验证明,EFP无明显细胞毒作用,而对荷瘤小鼠却存在显著的抑瘤效果,在EFP浓度2.90 mg·kg-1对S180腹水瘤、2.18 mg·kg-1对H22肝癌和0.73～1.45 mg·kg-1对S180实体瘤的荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用, 在S180实体瘤实验中，高浓度EFP对小鼠的抑瘤率与环磷酰胺相似，在H22实体瘤实验中，在低浓度（0.73 mg·kg-1）下，抑瘤率最高，通过脾重测定，可知在高浓度下小鼠脾重最大，说明，地鳖蛋白对S180和H22肿瘤细胞均具一定的抑制作用，且抑制效果和环磷酰胺相差无几。实验表明EFP对S180等细胞无杀伤效果，说明EFP抗肿瘤作用不是通过直接杀伤肿瘤细胞，我们认为EFP对小鼠移植瘤的生长抑制作用很可能与其纤溶酶活性有关，与纤溶酶抑制肿瘤血管生成关系密切。
       
       许多疾病的病理过程都涉及到新生血管生成，包括肿瘤生长等疾病。早在1971年Folkman就提出了“肿瘤生长依赖血管生成”的观点，并提出了“抑瘤与抗血管生成的概念”。近年来大量研究已证明肿瘤血管生成在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用，肿瘤组织既可通过肿瘤血管从宿主获取营养和氧气，又可通过肿瘤血管向机体的其他部位输送转移细胞，继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移［9］。中医也认为肿瘤的发生是由于正气不足，脏腑功能失调，气滞、血淤、痰凝、毒聚而形成。现代医学证实，癌症患者血液（浆）多呈高粘高凝状态，这不仅阻碍药物对肿瘤细胞的直接杀伤作用，而且有助于癌细胞的转移、定居和增殖。活血化淤中药抑癌理论提出，活血化淤中药通过改善患者血液黏滞状态，改善血液循环,增加局部血流量,改善局部缺氧,而抑制瘤栓的形成，使肿瘤细胞不能在血循环中存活［10］，这样对血瘤细胞起到了直接或间接的抑杀作用，从而达到防治恶性肿瘤血行转移的目的，同时也使抗癌药物及其它成分易于深入瘤体而充分发挥作用。
       
       有关研究表明，活血化淤药物影响肿瘤生长及转移机制与抑制新生血管生成关系密切，有关研究证明纤溶活性蛋白酶及其活性产物,可以大量降解肿瘤细胞外基质,使肿瘤细胞丧失生存的环境基础,而且导致肿瘤组织自身的降解,反而不利于肿瘤的侵袭转移［11］，纤溶活性物质具有抑制内皮细胞增生，从而阻碍肿瘤血管的形成和肿瘤转移灶建立的作用。基于上述理论，我们认为EFP的抑瘤效应可能与其对肿瘤新生血管的抑制作用有关。为此，我们认为EFP很可能是地鳖中的一种有效、低毒的抗肿瘤成分，其主要有望在抑制肿瘤生长和转移方面发挥效应，是一个具有应用前景的抗肿瘤天然药物。
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