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       【摘要】 
       目的建立瑞香狼毒药材蛋白质部位体外活性研究的方法。方法琼脂糖扩散法测定总蛋白的抑菌活性；MTT细胞培养法测定总蛋白及分离得到的6个分子量蛋白对肝癌细胞生长的抑制作用及对正常细胞的毒性作用。结果体外活性研究结果表明，总蛋白没有抑菌活性但具有抗肿瘤活性和细胞毒性；分离得到的6个分子量的蛋白中2、3、4、6对肿瘤细胞有抑制作用，1、3、4对正常细胞有毒性作用。结论实验方法可作为瑞香狼毒药材中蛋白质生物活性研究的方法，为瑞香狼毒蛋白质部位的毒性蛋白及活性蛋白的研究提供了方法依据。
       【关键词】  瑞香狼毒； 蛋白质； 体外活性
       Study on in vitro Activity of Protein Site from Stellera chamaejasme L.
       BO Yukun,ZHOU Yan,WANG Wei,WANG Yuhua
        
       （Inner Mongolian Medical College, Inner Mongolia,Hohhot 010110,China;Inner Mongolian Institute for Food and Drug Control, Hohhot, Inner Mongolia 010030,China）
       Abstract：ObjectiveTo set up the method of detecting in vitro activity of protein site from Stellera chamaejasme L.MethodsThe method of agar diffusion was used antibacterial activity of total protein; MTT cell cultural technique was adopted to measure the cell activity of total protein and the six molecular weight proteins isolated from total protein. ResultsThe study of in vitro activity indicated that the total protein was lack of antibacterial activity but had the function of anti-tumor and the activity of toxicity; the proteins of  2,3,4,6 had the function of anti-tumor and the 1,3,4 have the toxic effect to normal cells.Conclusion In this paper, the method can be used to study the biological ammity of the protein of Stellera chamaejasme L.
       Key words：Stellera chamaejasme L.；  Protein ；  In vitro activity
       瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.的干燥根，又名断肠草、红狼毒、火柴头花等［1］，它广泛分布在我国西北、西南、东北及河北等地。瑞香狼毒始载于《神农本草经》，历代本草均有记载；其味苦、辛，性平、有毒，入肺、脾、肝经，功能与主治为逐水祛痰、破积杀虫。瑞香狼毒是蒙医药常用的药材，作为主成分制成的蒙成药多用于治疗乳腺炎和腮腺炎。瑞香狼毒毒性大，经炮制后才入药。误食或过量，会刺激口腔、咽喉，并可见恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头晕头痛、疲乏无力，严重者会出现狂躁和痉挛［2］。瑞香狼毒主要化学成分有香豆素、黄酮、二萜原酸酯、木脂素类化合物、多糖等［3］。近年来的研究显示［4，5］，瑞香狼毒具有抗肿瘤、抗病毒、抗HIV病毒、抑菌、抗癫痫、抗惊厥等作用；瑞香狼毒作为生物杀虫剂使用，原理是利用其药材的毒性作用。瑞香狼毒药材中毒性成分以及活性成分的研究对确定瑞香狼毒的炮制方法，从而确保安全、合理的使用瑞香狼毒药材具有重要意义。本文就蛋白质部分的体外活
       性进行了研究。
       1  材料与仪器
       1.1  材料
       瑞香狼毒药材（经内蒙古食品药品检验所康双龙主任药师鉴定）；细胞株（体外培养人肝癌细胞株HepG-2，狗肾细胞株）；MTT（德国simga公司）；RPMl-l640（美国GIBCO公司，批号：60P8244）；胎牛血清（FBS Mdgenics Inc.，批号：CCS0011-100）；青霉素、链霉素（华北制药股份公司）；胰蛋白酶（上海化学试剂厂，批号：82-04-12）；MEM（美国）；二甲基亚砜(DMSO天津汇英化学试剂有限公司)；碳酸氢钠（开原化学试剂厂）。  
       
       1.2  仪器Thenno Fomra型CO2培养箱（池本梨花工业株式会社）；Clympus型倒置显微镜（日本）；DG3022A型酶标仪（国营华东电子管厂）；FA1104型电子天平（上海精科天平）；培养瓶（日本）；3072型96孔板（丹麦）；3001型培养皿（美国）；JJT-2型超净工作台（北京半导体设备一厂）；YXQG02型电热式蒸气消毒器（山东新华医疗器械股份有限公司）。
       2  方法与结果
       2.1  蛋白质的提取分离本实验通过水提、盐沉、透析的提取过程，SephadexG-150、SephadexG-100、SephadexG-50凝胶柱多次分离过程，SDS-聚丙烯酰胺蛋白质电泳鉴别过程，共得到6个分子量的蛋白质。它们的分子量分别为：14.4，35.0，28.0，23.0，10.0，94.0 kDa。为了进一步确定瑞香狼毒的活性部位，本实验对瑞香狼毒中的总蛋白及其分离得到的不同分子量的蛋白进行了体外活性研究。
       2.2  瑞香狼毒总蛋白的体外活性研究
       2.2.1  总蛋白的毒性实验［6］取对数生长期狗肾细胞，用胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×104 cll/ml（MEM培养基培养），接种于96孔培养板中，100 μl/孔。然后在实验孔中加入100 μl样品的培养基，每一浓度级别平行3孔。对照组加入等体积溶剂。将96孔培养板置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养72 h后，弃去培养液，每孔加入新鲜配置的含0.20 mg·ml-1MTT的无血清培养基20 μl，37℃下继续培养4 h后，除去上清液。每孔加入150 μl DMSO溶解formazan沉淀，置微量震荡器上振荡5 min使其充分溶解。在DG3022A型酶标仪上测定490 nm处的A（吸收度）值。结果见表1。表1  瑞香狼毒中总蛋白质对正常细胞的毒性研究结果（略）
       
       总蛋白的毒性研究和对肝癌细胞的研究使用的样品均为：将总蛋白分别制成浓度为0.49，1.02，2.09，4.11，6.06，8.07 mg/ml的溶液，并分别编号为1，2，3，4，5，6。
       
       从表1可以看出，当蛋白溶液浓度增至4.11 mg·ml-1时，A值低于空白溶液的A值，出现细胞毒性作用，随着浓度的增大，对细胞生长的抑制率增大，毒性作用不断加强。
       2.2.2  总蛋白对肿瘤细胞的活性实验［6］取对数生长期的肝癌细胞HepG-2，用胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×104 /ml，接种于96孔培养板中，100 μl/孔。加入100 μl  RPMI-1640培养液，然后在实验孔中加入100μl样品溶液，每一浓度级别平行3孔。同时设立空白对照，并用抗癌药物环磷酰胺（CPM）做阳性对照。将96孔培养板置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养96 h后，弃去培养液，每孔加入新鲜配置的含0.20 mg·ml-1MTT的无血清培养基20 μl，37℃下继续培养4 h后，除去上清液。每孔加入150 μl DMSO溶解formazan沉淀，置微量震荡器上振荡5 min使其充分溶解。在DG3022A型酶标仪上测定490 nm处的OD（吸收度）值。瑞香狼毒总蛋白对肝癌细胞生长抑制结果见表2。表2  瑞香狼毒中总蛋白质对肝癌细胞生长抑制率结果（略）
       从表2可以看出，总蛋白溶液从浓度为2.09 mg·ml-1开始出现抑制肝癌细胞生长的现象，并随浓度增加抑制肝癌细胞生长的强度越大。
       2.2.3  总蛋白的抑菌实验［7,8］
       
       菌株的培养：在无菌操作条件下，用接种环取金黄色葡萄球菌菌株一环，用划线法接种在制作好的培养基中，然后用不同接种环分别以同样方法对铜绿假单胞菌进行接种。把各菌种置37℃恒温培养箱中培养24h，然后取出放入4℃冰箱中保存备用。
       
       供试品溶液的制备：精密称取瑞香狼毒总蛋白样品85.2mg，加入4 ml蒸馏水溶解即得。
       样品灭菌：将盛有总蛋白样品溶液的小瓶在水浴中煮沸10 min。然后将样品溶液转移至灭菌的试管中，再煮沸10min灭菌即可。
       
       将每个涂布菌液的培养皿上，均匀的放置6个钢管，每个钢管中滴加一个样品。在滴加过样品的培养皿上盖上陶瓦盖将其密封，于37℃恒温培养箱中培养24h后取出观察样品的抑菌圈。实验结果显示，瑞香狼毒总蛋白溶液对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均没有抑菌圈出现，说明瑞香狼毒中蛋白质部位对这两种菌的生长没有抑制作用。
       2.3   瑞香狼毒分离得到的各分子量蛋白的细胞实验从总蛋白的体外活性研究实验结果可以看出，瑞香狼毒中的蛋白质对细菌生长没有抑制作用，但对肿瘤细胞和正常细胞有抑制和毒性作用。为了进一步确定它的抗肿瘤活性和毒性作用，本实验对从总蛋白分离得到的6个分子量的蛋白质分别进行了细胞活性研究。
       2.3.1  供试品溶液的配制精密称取蛋白质1～6的粉末，用一级纯化水制成约10 mg·ml-1的溶液，在无菌操作下用0.45μm高压灭菌后的滤膜过滤即得。
       2.3.2  抗肿瘤活性的实验按“2.2.2”项下方法测定各分子量蛋白对肝癌细胞的作用。结果见表3。表3  瑞香狼毒中6个不同分子量蛋白质对肝癌细胞生长作用结果（略）
       表3结果显示，有4个分子量的蛋白对肝癌细胞的生长有抑制作用。它们分别是：分子量为35.0 kDa，肝癌细胞抑制率57.9%；分子量约28.0 kDa，肝癌细胞抑制率57.9%；分子量约23.0 kDa，肝癌细胞抑制率86.8%；分子量94.0 kDa，肝癌细胞抑制率68.4%。
       2.3.3  对正常细胞的毒性实验按“2.2.1”项下方法测定瑞香狼毒中6个不同分子量蛋白对正常细胞毒性作用。结果见表4。表4  瑞香狼毒中6个不同分子量蛋白质对正常细胞作用结果（略）
       细胞毒性实验中，若蛋白质样品的OD值小于空白溶液的OD值，则说明该分子量的蛋白质对细胞有毒性作用。表4显示，OD值小于空白溶液OD值（0.08）的蛋白质有3个，说明这3个蛋白质对细胞有毒性作用。它们的分子量分别是： 14.4 kDa；约28.0 kDa；约23.0 kDa。
       
       瑞香狼毒总蛋白质的抑菌实验和细胞活性研究结果表明，瑞香狼毒药材中蛋白质部位对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌没有抑菌作用，但有对肿瘤细胞生长的抑制作用和对正常细胞的毒性作用。
       
       各分子量蛋白的体外活性的研究表明，分子量约为28.0 kDa和23.0 kDa的两个蛋白同时具有对肿瘤细胞生长的抑制作用和对正常细胞的毒性作用；分子量为35.0 kDa和94.0 kDa的蛋白只有对肿瘤细胞的抑制作用；分子量为14.4 kDa的蛋白只有对正常细胞的毒性作用。
       3  讨论
         
       瑞香狼毒药材作为常用的蒙药材，具有重要的药用价值。总蛋白的抑菌结果显示，瑞香狼毒蛋白质溶液对这两种菌落的生长均没有抑菌环出现，说明瑞香狼毒中的蛋白质部位对瑞香狼毒药材的抑菌活性没有贡献，不能作为抑菌药物使用。在总蛋白质的体外活性实验中，我们还就其对正常细胞的毒性作用和对肿瘤细胞的抑制作用进行了研究。研究结果显示，瑞香狼毒中的蛋白质部位对正常细胞有毒性作用，同时对肿瘤细胞的生长也有抑制作用，作用强度随着浓度的增加而增强。
       
       由于瑞香狼毒中总蛋白质部位有抗肿瘤活性和毒性作用，为了确定它的这些功能是由哪些分子量的蛋白质引起的，我们对其分离得到的6个分子量的蛋白质进行了进一步的细胞活性研究。研究表明，6个分子量的蛋白质中有3个对正常细胞有毒性作用，有4个对肿瘤细胞有抑制作用。其中有抗肿瘤活性而没有毒性的有两个，它们的分子量为35.0 kDa和94.0 kDa。
       【参考文献】
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