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       【关键词】  活性炭
       摘要：目的从栀子黄废液中分离纯化京尼平苷。方法采用两步吸附分离法，即先采用活性炭从栀子黄废液中吸附分离京尼平苷，纯度可达17.56%，然后再用HPD100大孔树脂进一步纯化京尼平苷。结果纯度可达58.42%。结论该项工艺操作简单，为工业化生产京尼平苷打下基础。
       关键词：京尼平苷；栀子； 分离纯化
       Isolation and Purification of Geniposide from Gardenia Yellow Waste Liquid by Active Carbon and Resin
       LIANG Huazheng， LI  Weiwei， PENG Lingxi， LI Yuan， LE Zhanggao
       (Biology Department, East China College of Science and Technology，Fuzhou, Jiangxi 344000, China)
       Abstract:Objective Isolation and purification of Geniposide from Gardenia yellow waste liquid with double adsorb and purify were studied. MethodsFirst, used the active carbon to isolate geniposide from the liquid, then used HPD100 macroporous resin to purify it.ResultsThe finished product’s purity achieved 58.42%.ConclusionThis technology is simple and can be used for industrial production.
       Key words：Geniposide; Gardenia fruit; Isolation and purification
       栀子苷也称京尼平苷（geniposide），结构见下图左，是一种环烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是栀子的主要药效成分，含量随产地的不同在3%～8%左右，可被β-葡萄糖苷酶水解为京尼平（结构见下图右）。研究表明，京尼平苷对消化系统、心血管系统和中枢神经系统疾病均有显著疗效［1］，此外，京尼平苷还有一定的抗炎和治疗软组织损伤的作用。京尼平苷除了药用以外，在其它领域也得到广泛的应用，如可用作植物增产剂［2］、生物检测剂［3］和生物载体［4］。随着对京尼平苷研究的不断深入，其应用前景将更加广阔。
       目前，京尼平苷的提取方法一般采用氯仿、无水乙醇等有机溶剂在索氏提取瓶中提取，得到栀子中总的活性成分栀子总苷，然后再上硅胶柱分离，用一定比例的甲醇、氯仿混合液洗脱，洗脱液在丙酮中进行重结晶得京尼平苷晶体，一般100 g栀子果中可分离得到4.0 g左右京尼平苷［5~7］。I.H Pan等［8］采用双水相系统从栀子中分离提取京尼平苷，该系统包括PE62(20%乙烯氧化物和80％丙烯氧化物的共聚物)、KH2PO4和乙醇，通过实验发现，100 g栀子果实可得到近8 g京尼平苷，纯度可达到77％。大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的有机高聚吸附剂，是一种吸附和筛选原理相结合的分离材料。近年来大孔树脂已逐渐应用于中草药有效成分的提取和中药新药的开发研制中，目前关于大孔树脂分离栀子中京尼平苷的报道较少，吕茂平等［9］用大孔树脂D301R分离栀子中京尼平苷，能与栀子黄色素等杂质较好地分离，收率在65％以上，但纯度未见报道。
　
　　本项目利用活性碳联合大孔树脂吸附法，将京尼平苷较好地进行了分离，得到较高纯度的产品，且该方法具有低成本，易工业化扩大生产的特点。
       　1 材料与方法
       1.1 试剂栀子（江西天顺生态农业有限公司）；大孔树脂HPD100，HPD400，D301（沧州宝恩化工厂）；大孔树脂HZ801B，HZ801，HZ201，335，D301R，802，803（上海华震科技贸易公司）；活性炭（200目）（江苏省溧阳市活性炭联合工厂）；栀子苷对照品（中国药品生物制品检定所，编号为110749200410）β－葡萄糖苷酶（Worthington Biochemical Corporation，3.4U・mg1）；0.132 mg・ml1栀子苷对照溶液；0.5U・ml1β葡萄糖苷酶溶液(用pH=5.0的0.1 mol/L的乙酸缓冲液配制)；1%的精氨酸溶液；其他试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。
       1.2 仪器UV751GD紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；HL1B数显恒流泵（上海精科实业有限公司）；BS223S电子天平（北京Sartorius 仪器系统有限公司）；LRH150Z振荡培养箱（广东医疗器械厂）。
       1.3 实验方法
       1.3.1  栀子黄废液的制备称取50 g栀子干果，用10倍量去离子水浸泡12 h，过滤后取滤液，经树脂吸附栀子黄色素后的溶液，即为栀子黄废液。
       1.3.2 活性炭吸附京尼平苷
       1.3.2.1 活性炭的预处理将活性炭（200目）用无水乙醇浸泡2 h，然后再用去离子水反复冲洗，备用。
       1.3.2.2  活性炭分离京尼平苷称取50 g活性炭加入500 ml栀子黄废液中，室温搅拌吸附5 h后，抽滤，得活性炭。用500 ml去离子水冲洗活性炭，再用500 ml10%乙醇溶液冲洗，将洗涤后的活性炭用200 ml无水乙醇洗脱，抽滤，滤液经低温干燥后即为京尼平苷粗品。
       1.3.3 大孔树脂纯化京尼平苷
       1.3.3.1树脂预处理将大孔树脂用无水乙醇浸泡2  h后，用去离子水反复冲洗，备用。
       1.3.3.2 树脂纯化京尼平苷将所得京尼平苷粗品溶解配制成1%溶液，上大孔树脂柱吸附，饱和后用适当浓度乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，低温干燥即得纯化后的京尼平苷产品。
       1.3.4 京尼平苷标准曲线的制作与产品纯度检测分别取京尼平苷标准溶液（0.132 mg・ml1）0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 ml于10 ml量瓶中，每瓶补水至4 ml，分别加入1.0 ml乙酸缓冲液(pH=5.0)，混匀后再加入1.0 ml β葡萄糖苷酶溶液，50℃水浴水解2 h， 然后再加入1.0 ml 2%精氨酸溶液，80℃水浴中反应1 h，定容至10 ml量瓶中，然后在590 nm波长下测定吸光值，即得标准曲线。
       取一定量产品配成一定浓度溶液，取该溶液2 ml再加2 mlβ葡萄糖苷酶溶液，50℃水浴水解2 h，然后取2 ml水解液加2 ml精氨酸溶液，80℃显色反应1h，然后在590 nm处测吸光值A，对照标准曲线得其纯度。
       　　2 结果与讨论
       2.1活性炭与大孔树脂吸附京尼平苷的性状分别取处理好的活性炭与大孔树脂5 g，加入到已测A238 nm的20 ml栀子黄废液中，振荡吸附12 h，抽滤，测滤液A238 nm 。结果见表1。表1  不同吸附剂对京尼平苷的吸附情况（略）
       从表1可以看出活性炭和HPD100对京尼平苷的吸附量较大，所以选用活性炭和HPD100作为纯化京尼平苷的吸附剂。
       2.2 活性炭吸附分离京尼平苷按步骤1.3.2.1预处理50 g活性炭，加入500 ml栀子黄废液中，室温搅拌吸附5 h。吸附前A238=500×0.567，吸附后A238=20×0.284,吸附后抽滤得活性炭，用去离子水冲洗，再用10%乙醇溶液冲洗,再用无水乙醇洗脱，抽滤，得滤液，低温干燥后得粗产品3.31 g。
       2.3 HPD100纯化京尼平苷
       2.3.1 吸附条件的选择
       2.3.1.1 温度对吸附的影响研究了不同温度下，树脂的吸附情况。分别取20 ml浓度为1%的粗产品溶液，在20，30，40，50℃震荡吸附12 h，测其吸附率。结果见图1。由图1可知，温度对吸附率的影响不是很大。因此，选在室温（25℃）下吸附。
       2.3.1.2  流速对吸附的影响上柱流速是影响树脂吸附的一个重要因素。考察了不同流速对树脂的吸附率的影响。结果见图2。由图2可知，当流速为3 ml/min时，树脂吸附率最大。因此选用3ml/min为吸附最佳流速。
       2.3.2 洗脱条件的选择
       2.3.2.1 洗脱剂的选择考察了不同洗脱剂的洗脱效果。取适量吸附后的树脂，分别加入不同的洗脱剂洗脱。然后测洗脱液238 nm处的吸光度值。结果见表2。由表2可知，70％乙醇溶液洗脱率最大，因此选用70％乙醇溶液作为洗脱剂。表2 不同洗脱剂的洗脱效果洗脱剂（略）
       2.3.2.2 流速对洗脱的影响流速是影响洗脱效果的重要因素，本文研究了不同流速对洗脱的影响。结果见图3。由图3可知当洗脱流速为5 ml/min时，达到最佳洗脱效果，因此选用5ml/min为洗脱流速。
                    
　　2.3.3 HPD100吸附纯化京尼平苷取京尼平苷粗品2 g，溶解后稀释成1%溶液。按1.3.3.1预处理HPD100树脂50 g，装柱，然后将粗产品溶液以3 ml/min上HPD100柱，饱和后用去离子水洗。再用70%乙醇溶液以5 ml/min洗脱，收集洗脱液，低温干燥得京尼平苷产品0.876 g。
       2.4 标准曲线的制作按方法1.3.4作标准曲线。结果见图4。
       从图4可知，京尼平苷浓度在1.3～52.8 μg・ml1范围内呈线性关系，其线性回归方程为Y= 0.240 9 X + 0.003 6，相关系数r=0.999 8，溶液吸收系数为 1.86×104 ml・g1・cm1。最低检测限为0.66 μg・ml1。
       2.5 产品纯度的检测粗产品纯度的检测：取一定量粗产品配成0.1%溶液，取2 ml再加2 ml β葡萄糖苷酶溶液，50℃水浴水解2 h，然后再取2 ml水解液加2 ml精氨酸，80℃显色反应1 h，然后在590 nm处测吸光值A=0.805，对照标准曲线得其纯度为17.56%。
京尼平苷成品纯度的检测：取一定量京尼平苷成品配成0.02%溶液，取2 ml再加2 mlβ葡萄糖苷酶溶液，50℃水浴水解2 h，然后再取1ml水解液加2 ml精氨酸，80℃显色反应1 h，然后在590 nm处测吸光值A=0.359，对照标准曲线得其纯度为58.42%。
       　　3 结论
       研究了京尼平苷提纯的工艺，采用两步吸附分离法，即先采用活性炭从栀子黄废液中吸附分离京尼平苷，然后再将粗产品溶液以3 ml/min上HPD100柱，吸附饱和用70%乙醇溶液以5 ml/min洗脱，收集洗脱液，低温干燥即得京尼平苷成品，纯度达58.42%。该项工艺操作简单，为工业化生产京尼平苷奠定了基础。
       　　参考文献：
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       ［8］Pan I H, Chiu H H, Lu C H. Aqueous two-phase extraction as an effective tool for isolation of geniposide from gardenia fruit［J］.Chromatogr. A, 2002, 977：239.
       ［9］吕茂平，乔庆彬，庞春艳，等．大孔树脂对栀子苷分离效果的研究［J］.中草药，2002，33(7)：794.
       基金项目：江西省自然科学基金资助项目（No.0430003）
       作者简介：梁华正(1966)，男(汉族)，江西临川人，现任东华理工学院副教授，硕士学位，主要从事天然产物的研究工作.
       (东华理工学院，江西 抚州344000)
       收稿日期：20050701；