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       【关键词】  益骨
        摘要：目的：观察益骨胶囊治疗用药对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，以探讨益骨胶囊治疗骨质疏松症的可能机理。方法：36只10月龄SD雌性大鼠随机抽取12只为假手术组，剩余24只待手术造模后随机分为2组：模型组、益骨胶囊组；以双侧卵巢切除法复制骨质疏松模型；采用RT-FQ-PCR方法检测骨组织Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果：益骨胶囊组骨组织Ⅰ型胶原mRNA表达明显高于模型组(P＜0.05)，与假手术组相近(P＞0.05)。结论：益骨胶囊能促进骨组织Ⅰ型胶原mRNA基因表达。
        关键词：益骨胶囊；骨质疏松症；大鼠；Ⅰ型胶原
        Effects of Benefiting-bone Capsule on Expression of mRNA of Type Ⅰ Collagen in Bone Tissue of the Ovariectomized Rats
        ZHANG Ronghua1,2, PENG Yong3, YANG Li1, CAI Yu2, ZHU Xiaofeng1
        (1.First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, China; 2.Pharmaceutical School of Jinan University, Guangzhou 515000, China; 3.Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine 515000, China)
        Abstract:Objective:The research was to investigate the effects of Benefiting-bone capsule (BBC) on the expression of mRNA of Type I collagen in bone tissue of the ovariectomized rats to further explain the mechanism of BBC on preventing and treating osteoporosis.Methods:12 rats were randomly selected from 36 female SD rats aged 10 months which were equally divided into group of sham operation with normal physiological saline.The left 24 rats were randomly divided into 2 groups after ovariectomy:group of osteoporotic animal model with normal physiological saline,treated group of osteoporotic animal model with BBC.Each group included 12 rats.Ovariectomy was used to establish the osteoporotic animal model and the expression of Type I collagen mRNA on gene level in bone tissue was detected by real time fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR) method.Results:The expression of Type I collagen mRNA on gene level in bone tissue of group of osteoporotic animal model with BBC was higher than group of osteoporotic animal model (P＜0.05),which was closed to group of sham operation.Conclusion:BBC can improve the expression of bone tissue Type I collagen on mRNA level of the rats performed by ovariectomy.
        Key words:Benefiting-bone capsule;Osteoporosis;Rats;Type I collagen
        本研究从骨组织Ⅰ型胶原mRNA基因表达角度观察确有临床疗效的中药复方制剂益骨胶囊［1］对骨I型胶原产生的影响，以阐明其防治骨质疏松的可能作用机理。
           1材料与方法
        1.1实验药物益骨胶囊由淫羊藿、枸杞子、熟地黄、牛膝等组成，深圳三九医药股份有限公司提供免煎颗粒，配制成水溶液，益骨胶囊组每毫升含生药1.0 g。
        1.2动物造模、分组实验采用10月龄Spragne-Dawley(SD)雌性大鼠，体重(380±20)g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：粤检证字第2002A024号。36只普通级10月龄SD雌性大鼠随机抽取12只为假手术(腹部切口但不切除卵巢)组，余24只行腹部切口双侧卵巢切除术后造模后随机分为2组，每组12只。各组均在手术后第13周开始灌胃，1次/d，12周为1个疗程。假手术组、模型组每天给予生理盐水1.16 ml/100 g灌胃；益骨胶囊组每天分别给予益骨胶囊溶液1.16 g/100 g(相当于成人日临床用量的1倍)。
        1.3检测指标和方法
        1.3.1骨组织RNA提取在手术24周后，将处死的大鼠置于冰上，迅速取出双侧股骨头，用滤纸吸干表面液体；将股骨头(约200 mg)置于盛有液氮的研钵内，快速研成粉末状；迅速将粉末移入匀浆器，加入TRIzol(100 mg组织＋2 ml TRIzol)，冷冻匀浆，将匀浆后液体分装入EP管内，15～30℃孵育5 min；加入氯仿(0.2 ml异丙醇/1 ml TRIzol)，盖紧盖子，用力摇动15 s，15～30℃孵育2～3 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清液至新EP管内；加入异丙醇(0.5 ml异丙醇/1 ml TRIzol)，15～30℃孵育样品10 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清液；75%冷乙醇洗涤沉淀1次(至少1 ml 75%乙醇/1 ml TRIzol),4℃ 7 500 r/min离心15 min，弃乙醇，空气或真空干燥5～10 min(不要完全干燥)；加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。
        1.3.2RNA完整性检测电泳检查：每样品取5 μl RNA置于1%的琼脂糖凝胶上电泳，泳毕，溴化乙锭染色20 min，置紫外灯下观察；紫外分光光度计扫描：每样品在紫外分光光度计上测定260 nm。
        1.3.3引物设计引物由Gene bank数据库中获得基因序列，采用Primer Expression 2.0软件(美国Applied Biosystem Inc)进行计算机辅助设计。Type I collagen引物序列：上游引物F：5’-GGC TTC TTC AAA CCA CTG CTTT-3’，下游引物R：5’-AAA GTC ATA GCC ACC TCC GCTG-3’，β-actin序列：上游引物F：5’-TCC TAG CAC CAT GAA GATC-3’，下游引物R：5’-AAA CGC AGC TCA GTA ACAG-3’。Type I collagen 基因扩增片断长度为254 bp，β-actin基因护增片断长度为190 bp。以上由上海生物工程有限公司合成。
        1.3.4逆转录反应取2 μl RNA模板做逆转录反应，试剂盒是德国Qiagen公司的逆转录试剂盒，反应体系如下：5×逆转录buffer 2  μl，下游引物(25 μm) 0.5 μl，dNTPs(10 mmol/L) 1 μl，MMLV(10U / μl)1 μl，DEPC水3.5 μl，RNA模板2 μl，总体积：10 μl。反应条件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 min。
        1.3.5荧光定量PCR反应(1)阳性标准模板的制备：取逆转录反应cDNA 5 μl，按以下体系反应：5×PCR buffer 10 μl，上游引物F(25 μm) 1 μl，下游引物R(25 μm) 1 μl，dNTPs(10 mmol/L) 1 μl，Taq 酶2 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 30 μl，总体积：50 μl。反应条件：93℃ 2 min，然后93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环，最后是72℃ 7 min延伸。PCR扩增产物长190 bp(β-actin)，经过2%低溶点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外下，割下目的条带。用回试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回收纯化。测定OD260/280＞1.8，表明纯度合格。用OD260测定值和片段长度数据换算出浓度(copy/μl)，再做10倍梯度稀释，制备成阳性定理标准品梯度。荧光定量阴性质控标准品采用灭菌双蒸水。(2)FQPCR测定：阳性定量标准品及样本均按以下反应体系进行，试剂盒购自美国ABI公司：5×SYBR Green l buffer 10 μl，上游引物F(25 μm)1 μl，下游引物R(25 μm) 1 μl，dNTPs (10 mmol/L) 1 μl，Taq酶(1U/μl)2 μl，cDNA(逆转录时总RNA取400 ng，反应体系10 μl)5 μl，ddH2O 30 μl。反应条件93℃ 2 min，然后93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃ 7 min延伸。荧光定量仪PE7000全自动荧光定量PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。反应结束后，由电脑自动分析并计算结果。1.4统计学处理数据用ANOVA法进行分析，数据以±s表示，检验水准取双侧α=0.05，所用软件为SPSS11.0。
           2结果
        见图1～4。
        图1解链曲线（略）
        图2解链曲线（略）
        图3测定的荧光定量阳性标准品梯度扩增曲线（略）
        图4荧光定量标准曲线（略）
        以每微升cDNA 所含目的基因的拷贝数与每微升cDNA 所含βactin的拷贝数的比值进行半定量比较。对去卵巢大鼠骨组织Ⅰ型胶原mRNA的影响，见表1。
        表1益骨胶囊治疗用药对骨组织Ⅰ型胶原mRNA的影响(±s)（略）
           3讨论
        近年来人们越来越强调骨有机基质对骨功能完整性及骨质疏松发生的作用。骨骼的有机物主要由Ⅰ型胶原组成，约占其含量的90%，骨的稳定性、可塑性和高抗张强度均源于胶原。Ⅰ型胶原不仅是骨的弹性和韧性的主要构成者，也是骨盐栖息的场所，骨Ⅰ型胶原的代谢状况与骨的代谢密切相关。骨胶原的过度降解或合成减少均可引起骨弹性和韧性降低，骨盐失去依附，溶解增多，会诱发骨质疏松。骨Ⅰ型胶原相关研究是揭示骨质疏松症发病机理及药物干预机制的重要手段。
        解链曲线图1分析：由于非特异产物(如引物二聚体)的解链温度(Tm)相对于特异性产物低，利用解链曲线可将特异和非特异产物区分开。特异性PCR扩增产物回收纯化后，制备成阳性定量标准品进行PCR扩增，此标准品的解链曲线为红色，如图所示，在80℃左右处形成单一的荧光峰。荧光定量阴性质控标准品采用灭菌双蒸水，解链曲线为绿色，如图所示，曲线比较平坦，未见明显的峰值，说明阳性标准品与阴性对照的解链曲线具有本质的区别，可以根据其曲线性质判断其特异性。图2解链曲线分析：样品经过PCR扩增后进行解链分析，在80℃左右处形成单一的荧光峰。峰值之前曲线比较平滑，未见其它杂峰，与图1的阳性标准品解链曲线完全一致，说明扩增产物具有很强的特异性。
        测定的荧光定量阳性标准品梯度扩增曲线分析：Ct(threshold cycle)又叫循环阈值，代表PCR循环过程中，最先检测到高于基线水平的荧光信号增长时所对应的循环数(或者说是每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)，它是实时定量PCR技术中进行定量的一个重要参数。在DNA扩增每个循环的过程中荧光信号值都被记录下来，并且与扩增产物的量成正比。在反应的起始，模板数越高，需要越少的循环数达到荧光信号阈值，阈值代表的荧光信号值显著大于背景信号。此时需要的循环数即是Ct，它总是出现在扩增的指数期。因此，定量过程不受反应组成的影响，而主要取决于反应体系的原始底物浓度。根据标准曲线，可对要扩增基因的原始模板浓度进行准确定量。图3为阳性标准品的实时荧光扩增曲线，扩增曲线平滑呈抛物线型，每条曲线均有明显的指数扩增期(荧光信号呈很陡的直线上升)。
        标准曲线分析：mRNA的定量分为相对和绝对两种。相对定量可用于判断基因转录的变化。但是在医学诊断方面，常需要准确判断一定数量细胞的绝对拷贝数，这就需要针对扩增基因制备阳性标准品梯度，通过标准品的回归曲线来准确定量样品的绝对拷贝数。在定量仪进行反应的过程中，电脑自动测定阳性标准品各浓度Ct值，Ct值为纵坐标，阳性标准品模板浓度的对数值为横坐标建立标准品的回归曲线，得到具有明确斜率(slope)、截距(intercept)的线性回归方程，根据样品的Ct值准确定量样品的浓度(即拷贝数)。本实验中，阳性标准品进行实时定量PCR后得到的标准曲线相关系数r2=0.99(实际上是相关系数的平方)，回归曲线具有良好的相关性，说明定量的结果准确、可靠。
        I型胶原作为骨的支架，它的质和量的任何病理变化均可导致骨骼疾病的发生。在正常情况下，骨胶原的生成和降解保持平衡状态。骨质疏松症中，除骨量减少以外，小梁骨的机械特性亦依赖于其微结构即组成它的有机物和无机物的分子结构。绝经后骨质疏松症由于雌激素缺乏，扰乱了骨髓中细胞因子的调节，同时雌激素启动破骨细胞凋亡的作用丧失［2～4］，雌激素对更年期骨质疏松的预防及治疗有明显的效果，并为临床试验所证实，其作用机理可能与促进成骨细胞I型胶原合成有关［5］。成骨细胞合成并分泌胶原分子，凝聚形成纤维。IL1，IL6，肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子的继发增高介导了破骨细胞数量增多，并且活化频率升高［6］，产生了大量的MMP1，使生成的胶原被过度的降解。人类破骨细胞内质网的存在及体外雌激素抑制破骨细胞吸收能力提示，雌激素对骨吸收作用是通过破骨细胞介导的。破骨细胞吸收过程中骨基质释放的因子，如转化生长因子、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子等可刺激成骨细胞转录mRNA，因而骨转换率升高。有报道显示，女性绝经后骨丢失与骨吸收显著增加有关，而男性主要因为骨形成下降［7］。
        绝经后骨质疏松症主要发生于松质骨［8］。股骨头松质骨的骨质疏松最为严重，且股骨颈突然变细而易由此处骨折［9］。大鼠与人均以股骨为最承重及活动量最大的部位，绝经后妇女因骨质疏松而骨折多发生在股骨颈部位，故本研究取材部位是大鼠的股骨。
        本实验结果显示：模型组Ⅰ型胶原mRNA的表达低于假手术组(P＜0.01)，益骨胶囊治疗组Ⅰ型胶原mRNA的表达高于模型组(P＜0.01)，接近假手术组(P＜0.05)。益骨胶囊治疗用药可以改善去卵巢大鼠骨组织Ⅰ型胶原mRNA的丢失。研究表明［10］去势大鼠骨组织Ⅰ型胶原mRNA的滴度较正常组明显降低，提示骨质疏松不仅涉及骨吸收，还有骨形成的降低。目前已有雌激素通过提高Ⅰ型胶原mRNA在骨的表达而预防骨质疏松发生的报道［11］。邵敏等［12］选用含药血清来进行实验，通过对成骨细胞矿化及成骨细胞免疫组化、原位杂交的研究，发现中药骨康血清加入成骨细胞培养体系后，成骨细胞内I型胶原表达升高。本研究显示益骨胶囊可以通过增加成骨细胞的Ⅰ型胶原mRNA表达水平，以促进成骨组织Ⅰ型胶原的合成，从而促进骨形成。
           参考文献：
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        (1.暨南大学附属第一医院，广东 广州510630；2.暨南大学药学院，广东 广州510632；3.广东省汕头市出入境检验检疫局515000)