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       【关键词】  硫化物；,,,蛋白质；,,,粪硫化物
       摘要：目的采用大鼠代谢试验方法以粪硫化物为指标研究高蛋白食物壅热伤脾机理。方法按配伍组设计方法将24只雄性SD大鼠随机分成豆组和肉组。每组动物先后饲以4个实验水平的大豆、肉类混合饲料，每一水平喂养8 d共32 d的实验膳食。收集大鼠第7，8天粪便，应用亚甲蓝方法通过微蒸馏过程测定粪硫化物含量。结果①豆组鼠粪硫化物浓度均数（0.27±0.14）μmol/g(P <0.05)；从10%~90%的浓度范围内，随饲料中大豆比例的增加，粪便中硫化物的浓度增加,呈正相关关系。②肉组大鼠粪硫化物浓度均数（0.19±0.11） μmmol/g（P>0.05）。③肉豆组间比较,肉和大豆在饲料中的比例大于70%时，粪硫化物浓度豆组大于肉组(P <0.05)。结论当肉、豆在食物中的比例相同时，高剂量下，大豆引起大鼠大肠硫化物的产生量更多，肠道毒性更大。
       关键词：硫化物；   蛋白质；   粪硫化物
       Effect of Soybean Protein on Sulfide Production in The Large Intestine in Rats
       MA Lixin,   DONG Yuping,   ZUO Qun,   FAN Jinshan,   JIA Lianchun, WU Liping ,  LIU Dianwu
 
　　(1.Hebei Medical Workers College, Baoding 071000, China; 2.Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017, China)
       Abstract：ObjectiveTo assess the relation between dietary soybean or meat intake level and fecal sulfide concentration. Methods24 adult male SD rats were randomly divided into soybean group and meat group according to randomized block design. In each group, six couple of rats were fed a sequence of 4 diet for 8d each. A partially randomized crossover design was used with four 8-d diets within 32d. On day 7 and 8 of each diet period, all faces of each cage were respectively collected, weighed for further analysis. Hydrogen sulfide was collected from the precipitate by a microdistillation procedure. We used the modified methylene blue method as the basis for total fecal sulfide determination. Results ① In soybean group, mean fecal sulfide concentration was (0.2±0.1)μmol/g (P<0.05). Mean fecal sulfide concentration in soybean group have positive correlation with dietary soybean proportion from 10% to 90% test level. ② In meat group, mean fecal sulfide concentration was (0.19±0.11)μmol/g (P>0.05). ③ The contribution to fecal sulfide concentrition of soybean group is more than that of meat group in high test level(>70%) of daily intake. ConclusionThe high quantity of soybean intake contributes to the larger output of sulfide production in the large intestine in rats than the pork meat intake at the same proportion. The more output of sulfide production, the more harmful to the large intestine mucosa.
       Key words：Sulfide;  Protein;  Fecal sulfide
   
　　大豆与猪肉都是中医食疗过程中常用的食药两用原料，它的大肠肠道内发酵产物-硫化氢对大肠粘膜细胞具有毒性作用，并与溃疡性结肠炎的发生、发展相关［1］。祖国医学认为：尽管大豆有很高的营养价值，但过多食用有“壅热伤脾”的作用。本文以粪硫化物为毒性指标，通过大鼠代谢试验，评价大豆与肉不同摄入水平与大鼠大肠硫化物产生数量的关系，以期为豆与肉食疗应用提供理论依据。本文采用配伍组设计的方差分析方法，通过32 d的大鼠喂养实验，评价大鼠摄食不同水平的大豆和肉类后，肠道硫化物的产生数量，变化趋势。也为进一步探讨人类食物结构及为溃疡性结肠炎的预防提供依据。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料
       饲料原料包括：肉类，来源于猪肉后臀尖部位瘦肉，绞成糜状；大豆，来于市售黄大豆，磨成粉状；还包括：玉米粉、小麦粉、小麦麸皮、盐、酵母粉、鱼肝油粉、胭脂红、胡萝卜，各实验水平鼠粮的配方比例见表1。大鼠饲料中热能和宏量营养素组成见表2。表1  各实验水平大鼠日粮配方组成实验水平（略）表2  大鼠饲米中热能和宏量营养素的组成（略）
       1.2  动物同窝别、7月龄SD雄性大鼠24只,体重350~400 g,由河北医科大学实验动物中心提供。
       1.3  主要仪器大鼠代谢笼,由苏州市冯氏实验动物设备有限公司提供,721分光光度计,普莱克斯高纯氮气钢瓶,洗气瓶。
       1.4  试剂硫化钠标准品，由天津天大化工实验厂提供。
       1.5  方法
       1.5.1  实验设计 
       每2只体重相同的大鼠组成一笼，共12笼，饲养于大鼠代谢笼中，按体重相同或相近的原则,每两笼组成一个配伍组,共6个配伍组,再按随机化原则,将每对配伍组动物随机分配到大豆组 或肉组［2,3］； 根据肉（或大豆）在大鼠日粮中的比例为10%，40%，70%， 90%的不同，每组动物各分为4个不同的喂养水平，通过随机数字表，决定喂养水平的先后次序。即对两组（肉类和大豆）各含4个不同喂养水平的大鼠实验日粮进行每一水平8 d，共32 d的大鼠喂养实验。
       1.5.2  粪便样品的收集与粪硫化物的测定
       每一实验组的每一水平的8 d实验期中，第7，8 天的新鲜粪便样本称重，在排出的30 min 内处理，硫化物以硫化锌沉淀的形式收集在测定样品中，样品再通过微蒸馏过程，以0.5 L/min流量的氮气，吹气30 min，将粪便样品中的硫化氢吹出，并收集于1 mol/L的NaOH溶液中。采用改良的亚甲兰分光光度法测定样品硫化物的含量［4］。
       1.5.3  数据处理 
       实验数据采用SPSS 11.5［5］进行录入分析；大鼠营养素摄入量的计算采用Excel 2000录入数据、中国CDC制作的中国食物成分数据库2002版光盘进行分析；统计结果以±s形式报告；采用配伍组设计的方差分析、多组样本均数的两两比较（LSD法）进行组内各水平试验结果的比较。大豆组与肉组组间均数的比较采用独立样本Ttest或两组比较的秩和检验方法；采用相关回归分析，以揭示大鼠豆类和肉类蛋白质摄入与粪便中硫化物浓度的关系。
       　　2  结果与分析
       2.1  大鼠体重实验期间每只大鼠体重实验前后无变化，其间每只大鼠体重的平均值为豆组(375±27.39)g,肉组(366.67±25.82)g ,两组大鼠体重无统计学差异(t=0.52,P>0.05)。
       2.2  实验期间每组大鼠平均蛋白质摄入量豆组(11.53±3.65)g/d/cage。F=54.96, P<0.000 1；肉组(10.1±3.53)g/d/cage。F=126.78, P<0.000 1。肉、豆两组大鼠蛋白质摄入量组间比较，由于方差不齐，采用两因素比较秩和检验：10%组 P >0.05，40%，70%组 P<0.001，90%组P<0.05，结果显示肉豆两组蛋白质摄入量在40%，70%，90%水平有显著差异，豆组蛋白质摄入量大于肉组蛋白质摄入量。
       2.3  大豆组大鼠粪便硫化物浓度大豆组大鼠粪便硫化物浓度见表3，方差分析结果：F=4.45, P< 0.05。显示豆组各喂养水平之间硫化物浓度总的来说存在差异；粪硫化物浓度的样本均数两两比较（LSD）：大豆含量 90%与10%，90%与40% 组粪硫化物浓度差异显著，P<0.05。而10%，40%，70%组间粪硫化物浓度差异无显著性。此外粪便硫化物浓度与饲料中大豆含量百分比的相关、回归分析显示：从10%至90%的浓度范围内，随饲料中大豆比例的增加（蛋白质比例也增加），粪便中硫化物的浓度增加，呈正相关关系,r =0.614,P< 0.001 ，回归方程＾     y =0.129+0.003 x 。表3  大豆组各实验水平鼠类硫化物浓度比实验水平（略）
       2.4  肉组粪便硫化物浓度肉组粪便硫化物浓度见表4，方差分析结果：F=3.2, P>0.05。显示肉组各喂养水平之间硫化物浓度差异无显著性。显示大鼠摄食肉类后大肠硫化物产生与大豆不同。表4  肉组各实验水平鼠类硫化物浓度比较实验水平（略）
       2.5  肉豆组间比较肉和大豆在饲料中的比例相同时，豆组和肉组组间粪硫化物浓度的比较结果见表5，显示70%水平和90%水平下，肉豆两组粪硫化物浓度存在差异，70%水平t=2.406, P<0.05；90%水平t =7.51, P<0.000 1。推测大鼠摄入同一重量比例的肉、大豆后，高浓度时大豆对粪中硫化物的贡献大于肉类。表5  同一实验水平下大豆与肉组间鼠类硫化物浓度比较实验水平（略）
       　　3  讨论
       溃疡性结肠炎属中医“泄泻”范畴，临床辨证见脾肾阳虚、肝旺脾虚、脾虚湿滞三种类型，多由于各种急慢性肠道疾病失治或误治迁延而成，且常与饮食失调有关。病理生理学的研究认为大肠硫化物损害结肠粘膜上皮细胞并与溃疡性结肠炎的发病机理相关［6,7］。病理实验研究结果显示如用0.2~1.0 mmol/L 的硫化物进行离体大鼠大肠灌注［8］，4 h后可促进肠道粘膜细胞凋亡与杯状细胞的功能衰减。Roediger［9］等用大鼠和人类的离体肠道粘膜组织进行实验，表明在2 mmol/L的浓度下硫化物还对肠道粘膜细胞丁酸盐的氧化过程起抑制作用；以粪硫化物为指标，可以为研究高蛋白食物过多摄入导致的饮食失调与壅热伤脾的机理研究提供实验依据。
       采用亚甲蓝方法测定人类粪便中硫化物的浓度是：0.66 umol/g［10］(n=14)和1.6 μmol/g(n=8)［11］,而本次测定结果大鼠粪便中硫化物浓度均数范围：大豆组(0.27±0.14)μmol/g，最大最小值范围：0.02~0.53μmol/g；肉组(0.25±0.14)μmol/g，最大最小值范围：0.09~0.41 μmol/g，结果与人类粪便中的硫化物的浓度接近；饲料中大豆占90%的水平组大鼠大肠硫化物产生量最高，为0.53 umol/g；此外，正常大鼠饲料中大豆比例在接近40%及以上时，肠道硫化物的浓度可能达到0.2 mmol/L的可能造成肠道损害的最小浓度。
       大豆组各喂养水平之间硫化物浓度存在差异（P < 0.05），而且从10%~90%的浓度范围内，随饲料中大豆比例的增加，鼠粪硫化物的浓度增加,呈正相关关系。Magee等［12］以人为实验对象、以牛肉为实验材料进行的研究也发现：随着膳食蛋白质摄入量的增加，人类粪便中硫化物的数量也呈正比例的增加。结合硫化物的病理学研究结果，不论人或动物，当过量的食物蛋白到达大肠后，都可能造成其酵解产物――硫化物产生增加，作为一种致病因子，导致肠粘膜出现损害或已有的损害加重，即高蛋白食物的壅热伤脾作用。
       本次研究结果首次证明食物含高浓度的大豆和肉食时，大鼠摄入同一重量比例的肉、大豆后，大肠硫化物的产生量在大豆组高于肉类组。原因是由于大豆蛋白质含量35%~40%，远高于肉蛋白质含量10%~12%,而且大豆蛋白质消化吸收率及生物学价值低于动物蛋白质，致使在摄食肉豆比例相同时，未消化吸收的大豆蛋白质到达大肠的数量远高于肉蛋白质的数量，蛋白质的有毒发酵产物-粪硫化物在豆组高于肉组。研究结果表明，尽管大豆营养丰富，还含有大豆异黄酮、皂苷等植物化学物，但在食疗和营养过程中，应因人而异，在蛋白质营养的利用和开发过程中，不应忽视其酵解产物-硫化物对肠粘膜的毒性作用。
       祖国医学通过长期的临床实践很早就认为［13］：大豆性味甘，平。入脾、大肠经。本品炒食易壅热伤脾，虚人及小儿不可食。煮食虽益人，但不宜多食。凡血燥、血热、皮肤有疾患或身体有毒病未愈者、消化功能减弱的脾虚患者不宜多食。通过本研究证明，大豆有“发热”的作用，而且这种“壅热伤脾”的效应可以通过大肠硫化物增多的毒效应及剂量反应关系加以解释。大豆用于食疗时应辨证论治，不可盲从。
       　　参考文献：
       ［1］Christl SU, Eisner HD, Scheppach W, et al. Effect of sodium hydrogen sulfide on cell proliferation of colonic mucosa［J］.Gastroenterology,1994，106: A664 .
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       ［12］Magee EA,Richardson CJ,Hughes R, et al. Contribution of dietary protein to sulfide production in the large intestine: an in vitro and a controlled feeding study in humans［J］. American Journal of Clinical Nutrition，2000,72( 6):1488.
       ［13］张拴才.常见食品的营养与食疗［M］.西安：陕西科学技术出版社，1995：10.
       1河北省职工医学院，河北 保定  071000； 
       2.河北医科大学，河北 石家庄  050017
       作者简介：马立新(1965)，女(汉族)，河北抚宁人，现任河北省职工医学院副教授，硕士学位，主要从事营养卫生研究工作.
       通讯作者简介：刘殿武(1956)，男(满族)，河北丰宁人，现任河北医大公卫学院教授，博士学位，主要从事慢性肝病发病机制和中药治疗作用的研究工作.