文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【关键词】  血竭；,,龙血素B；,,三叉神经节；,,河豚毒素不敏感型钠通道；,,有效成分
       摘要：目的研究血竭重要成分龙血素B对小鼠三叉神经节河豚毒素不敏感（TTXR）钠电流的作用。方法采用酶解法分离小鼠三叉神经节细胞，应用全细胞膜片钳技术，观察龙血素B对单个三叉神经节（trigeminal ganglion TG）细胞TTXR钠电流幅值的影响。结果龙血素B对TTXR钠电流呈浓度依赖性抑制 ,且抑制作用可逆;高浓度的龙血素B（0.2 mmol/L）加速TTX-R钠通道电流的失活过程,延迟其复活过程,对激活过程无显著影响。结论龙血素B显著抑制TTX-R钠电流，且这种抑制作用发生在钠通道的失活过程而非激活过程，这种作用可能是其镇痛作用的机理之一。
       关键词：血竭；  龙血素B；  三叉神经节；  河豚毒素不敏感型钠通道；  有效成分
       Modulatory Effects of Loureirin B on Tetrodotoxinresistance VoltageGated Sodium Currents in Trigeminal Ganglion Neurons
       ZHANG Fan， MA Quanshun， CHEN Su， YIN Shijin ， LIU Xiangming*
       （Biomedical Engineering Institute,SouthCentral China University for Nationalities,Wuhan 430074,China）
       Abstract:ObjectiveThe purpose is to search out the effective element of Loureirin B on tetrodotoxinresistance(TTXR) voltagegated sodium current(VGSC) in trigeminal(TG) neurons.MethodsThe TG neurons were enzymatically isolated from mice, and then the effect of Loureirin B on the TTXR VGSC was assessed using wholecell patchclamp technology. ResultsLoureirin B inhibits the TTXR peak sodium currents in a dose-dependent model and the inhibition is reversible. 0.2mmol/L loureirin B accelerates the inactive process of the TTXR sodium currents and delays the revivable process but does not affect the activitive process. ConclusionLoureirin B significantly inhibits the TTXR sodium currents and perhaps the inhibition is one of the ease pain mechanism of Loureirin B.
       Key words:Blood resin;  Loureirin B;  Trigeminal ganglion;  Tetridotoxin-resistance;  Voltagegated sodium current;  Effective element
   
　　近年来，血竭因其较强的镇痛效应而广泛应用于临床上颜面部的消炎镇痛［1］，随着血竭药理学研究的深入，对其镇痛机制的研究也从传统的在体动物实验发展到分子及细胞水平，血竭具有较强的外周镇痛效应［2］，这一结论提示我们，其镇痛效应除了跟传统认为的抗炎作用有关以外，还跟直接干预了外周痛觉信息的中枢传入有关。血竭本身作为一味中药，化学成分复杂，为了更好的利用和开发血竭的镇痛药效，并鉴于TG细胞电压门控性钠通道在头面部痛觉的产生和传导中的重要角色，我们开展了一系列的相关有效成分的研究，并初步确定血竭总黄酮为血竭镇痛效应的有效部位（群）［3］，龙血素B是血竭的重要成分之一，以往的研究证明血竭可以抑制大鼠脊髓背根神经节细胞膜上河豚毒素敏感性（tetrodotoxin sensitive，TTXS）电压门控性钠通道电流，而血竭的重要成分龙血素B很可能是其产生这一抑制作用的药效物质［4］。本研究主要是从龙血素B对三叉神经节河豚毒素不敏感型（TTXR）电压门控性钠通道电流的影响来探讨其镇痛的机理。
       　1  材料与方法
       1.1  记录液及实验用药实验于200503在中南民族大学生物医学工程研究所膜片钳实验室（国家民委重点实验室）完成。用于记录TG细胞钠通道电流的细胞内液成分为（mmol/L）： CsCl 100.0；KF40.0；CaCl2 1.0；MgCl2 2.0；EGTA（乙二醇四乙酸酯）10.0；HEPES［N双（2羟乙基）呱嗪N2（乙磺酸）］10.0； Na2ATP 5.0；TEACl（氯化四乙铵）20.0，用CsOH调pH值至7.2；细胞外液成分为(mmol/L)：NaCl 145.0；KCl 5.0；CaCl2 2.0；MgCl2 1.0; HEPES 10.0；DGlucose 10.0；4AP（4-氨基吡啶）1.0; TEACl 20.0，用TEAOH（氢氧化四乙铵）调pH值至7.3；在上述内、外液中分别加入1 μmol/L TTX（河豚毒素）配成用于记录TTXR钠通道电流的细胞内、外液。以上所用药物中TTX、EGTA、HEPES、TEACl及Na2ATP为Sigma公司产品，其它未注明的为国产分析纯。
       实验用药龙血素B（广西壮族自治区中医药研究所提供，卢文杰教授鉴定）用记录TTXR钠通道电流的细胞外液配制成以下三种浓度：0.2 mmol/L，0.02 mmol/L，0.002 mmol/L。
       1.2   TG细胞的急性分离选择1月龄左右的昆明种小鼠18~25 g，雌雄不拘，武汉大学医学院实验动物中心提供）用颈椎脱臼法处死后，取其两侧三叉神经节，置于4℃含氧饱和的DMEM/F12（Dulbecco′s Modified Eager′s Medium/F12）培养液(Gibco,外加14 mmol/L的NaHCO3,pH 7.4)中冲洗孵育，用虹膜剪剪碎后，采用酶解消化法(0.2 mg /ml胶原酶I（collagenaseⅠSigma）和0.1 mg /ml胰蛋白酶(trypsin Ⅲ Sigma)),在恒温水浴摇床(36℃,140 r/min) 孵育13 min后，用尖端经过热处理的pasteur吸管轻轻吹打数次，最后加入0.3 mg /ml胰蛋白酶抑制剂终止消化。经200目尼龙筛过滤到35 mm培养皿内，待细胞贴壁后更换外液2次，放在倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）静置15~20 min后，行全细胞膜片钳记录。整个实验均在室温22~25℃下进行。
       1.3  全细胞膜片钳记录采用全细胞记录方式记录TG细胞电压门控性钠通道电流，记录所用仪器及具体操作方法详见参考文献［5］。选用直径小于25 μm的TG细胞［6］，将电位钳制在90mV，进行全细胞膜片钳记录观察钠通道电流。
       1.4  实验资料的处理实验资料经pulsefit软件及IGOR软件进行分析处理，实验数据用（ ±s）表示。对各组数据分别进行t检验，以P<0.05作为显著性检验的标准。
药物对钠电流峰值 Imax的百分比抑制率用式（1）计算：
       其中I表示不同浓度药物对钠电流峰值的抑制率，Imax为最大抑制率，X表示药物的浓度，h为Hill系数，IC50表示药物的半数抑制浓度。
       　　2  实验结果
       2.1  TG细胞膜上电压门控性钠通道电流的分离采用上述细胞外液和电极内液记录钠电流，以电极内液中的CsCl和ClTEA及细胞外液中的4AP和ClTEA阻断钾通道电流，电极内液中的F+阻断钙通道电流。将膜电位钳制在90mV，施加适当的电压刺激，诱发电压门控性钠通道电流，见图1。选用直径＜25μm的TG细胞进行全细胞膜片钳记录，因为这类细胞跟伤害性痛觉信息的中枢传入密切相关。
       2.2  龙血素B对TG细胞钠通道电流峰值的影响将膜电位钳制在90 mV，从60 mV起给予10 mV步幅递增、80 ms步宽的去极化脉冲刺激至+60mV，激活钠通道，记录时每次给药前都用细胞外液冲洗并激活钠电流作为空白对照，按照浓度从低到高顺序，利用DAD给药系统依次喷射给药，记录后再用细胞外液冲洗。记录激活的钠通道电流的峰值，按照式（1）计算出不同浓度药物对钠电流的抑制率。结果见表1。表1   不同浓度的龙血素B对TG细胞钠电流峰值的抑制率药物浓度（略）
       通过上述资料发现3种浓度的药物对钠电流也均有不同程度的抑制，并呈明显的浓度依赖性，其中高浓度的龙血素B对钠电流的抑制率最大，将龙血素B的剂量经对数转换后，我们得到钠电流抑制率与药物的剂量之间的关系依赖性曲线（图2），用Hill方程： I/Imax=1     1+(IC50/x)h进行曲线拟合，得到药物的半数抑制浓度（IC50）为0.253 8 mmol/L，Hill系数h=0.378 9。
       观察高浓度龙血素B（0.2 mmol/L）对TG细胞钠通道电流峰值的抑制效果是否可逆。结果见表2。表2   高浓度龙血素B对TG细胞TTXR钠电流峰值的可逆性抑制药（略）
       2.3  龙血素B对TG细胞钠通道电流IV曲线的影响将膜电位钳制在90mV，从60mV起，给予10 mV步幅递增、80 ms步宽的去极化脉冲刺激至+60 mV，激活并记录钠通道电流，以刺激电压为横轴，以激活的钠电流为纵轴，得到给药前后的IV曲线。结果发现，3种浓度的龙血素B（0.002，0.02和0.2 mmol/L）对IV曲线的最大激活电压均无明显影响。结果见图3。
       2.4  龙血素B对TG细胞钠通道电流激活曲线的影响将膜电位钳制在90mV，从60mV起给予10mV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+60mV，引出钠通道电流。据式G=I     V-Vrev求出各测试电压所对应的通道电导值，并以测试电压为横轴，测试电压所对应的标准化电导值G/Gmax为纵轴，绘制给药前后电流的稳态激活曲线，用Boltzmann方程：I/Imax=1     1+e-V-V1/2     K进行曲线拟合，得出钠通道电流给药前后的半激活电压（V1/2）值。结果表明，正常TG细胞钠电流半激活电压为（38.58±3.28）mV（n=10），给予0.2 mmol/L龙血素B后半激活电压变为（37.43±2.50）mV（n=10，P＜0.05）。结果见图4。
       2.5  龙血素B对TG细胞钠通道电流灭活曲线的影响将膜电位钳制在90mV，采用双脉冲刺激方法观察钠通道电流的稳态失活情况，即先给予10mV步幅递增、30ms步宽、90mV~20mV的条件刺激电压，每一条件刺激后紧跟一30ms步宽的测试电压刺激，钠电流测试电压为0 mV。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Imax对条件刺激电压作图绘制稳态失活曲线，并用Boltzmann方程：I/Imax=1     1+e-V-V1/2     K进行曲线拟合，得出钠通道电流给药前后的半失活电压（V1/2 ）值。
       结果表明，正常TG细胞钠电流半失活电压为（31.25±1.90）mV（n=10），给予0.2 mmol/L龙血素B后半失活电压变为（41.02±2.27）mV（n=10，P＜0.05）。结果见图5。
       2.6  龙血素B对TG细胞钠通道电流复活曲线的影响将膜电位钳制在90mV，采用双脉冲刺激方法观察钠通道电流失活后的恢复情况，即在每一条件刺激电压后都施加一测试电压刺激，条件刺激电压和测试电压的宽度均为30 ms，两次刺激的时间间隔从2 ms开始，以2 ms等差递增至36 ms，钠电流条件刺激电压和测试电压均为0mV。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Imax对时间间隔t作图绘制失活后的恢复曲线，并用单指数函数：I(t)=A0+A1e-t     τ进行曲线拟合，得出钠通道电流给药前后失活后恢复的时间常数（τ），结果表明，正常TG细胞钠电流失活后恢复的时间常数为（3.82±0.83）ms（n=10），给予0.2 mmol/L龙血素B后变为（4.88±1.18） ms（n=10）。结果见图6。
       　　3  讨论
       对中药和天然药物进行有效成分研究和提取是揭示中医药的科学本质、开发创新药物的重要途径之一。    痛觉的通路以初级感觉神经元(背根神经元，DRG；三叉神经元，TG)开始， 其中，脊髓背根神经节主要传导躯体痛觉信息，而头面部痛觉信息的传入主要由三叉神经纤维来完成［7］，有文献报道,伤害性传入的生理调节和病理特征,都与初级感觉神经元特异性电压门控钠通道的功能调制和表达分布变化直接相关［3,6］，所以表达在初级感觉神经元上的电压门控钠通道已经作为重要的靶来研究疼痛的分子生理学及寻找新的镇痛剂。在以往的研究中，我们仅仅观察了血竭及其重要成分龙血素B对TTXS钠通道电流的影响，虽然TTXS和TTXR钠通道激活电流均参与了初级感觉神经元动作电位的产生，但是，TTXR钠通道专一性的表达在初级感觉神经元上，主要分布在参与痛觉产生的感觉神经元群体上（神经元胞体较小），它的激活阈值较高，激活，失活均较慢，稳态失活的发生需要膜的去极化，其在伤害性传入神经元的兴奋性产生中起着比TTXS钠通道更为重要的作用［8］。
       实验表明，龙血素B对小鼠三叉神经节TTXR钠通道有抑制作用。这种抑制作用随龙血素B浓度增加而增加，有明显的浓度依赖性，说明龙血素B对三叉神经节钠通道电流有强力阻滞作用。
       本研究观察到龙血素B对TTXR钠电流的抑制特性，结果显示其抑制作用具有电压依赖性。钳制电压在90mv的状态下，其对钠电流的抑制明显增强。由于钳制电位在90mv状态下，钠通道具有失活状态，因此龙血素B对TTXR钠电流抑制的电压依赖性说明龙血素B 对钠通道的作用与钠通道的状态有关［9］。这可能提示龙血素B对失活状态的钠通道较其他状态的钠通道更易结合。通过龙血素B对TTXR钠电流的激活与失活曲线的分析也证实了这一解释。龙血素B不影响TTXR钠电流的激活曲线，但可以使失活曲线发生明显的超极化左移。说明龙血素B对钠通道有直接的抑制作用，而且主要影响钠通道的失活而非激活过程。进一步研究发现应用脉冲刺激可提高龙血素B对TTXR钠电流的阻滞效力，从而也说明龙血素B优先结合钠通道的失活部分。结合本课题组以前的研究，可以说明龙血素B对TTXS和TTXR钠通道电流均有不同程度的抑制作用。
       　　参考文献：
       ［1］Xie Y K. Mechanism for chronic pain generation［J］.Chinese Science Bulletin, 2000, 45(9): 775.
       ［2］向金莲,张路晗,程 睿.血竭消炎止痛作用研究［J］.时珍国医国药,2001，12（2）：110.
       ［3］马全顺,尹世金,陈  素,等.血竭总黄酮对小鼠三叉神经节细胞河豚毒素敏感型钠通道电流的抑制作用［J］.中南民族大学学报(自然科学版),2004,3, 23(3):5.
       ［4］刘向明, 陈  素, 尹世金, 等.血竭及其成分龙血素B对背根神经节细胞河豚毒素敏感型钠通道电流的影响［J］.中国科学C辑, 2004, 34(1):1.
       ［5］Victoria H.John,Martin  J.Main,Andrew J.Powell,et al.Sidhu Heterologous expression and functional analysis of rat NaV 1.8(SNS)voltage-gated sodium channels in the dorsal root ganglion neuroblastoma cell line ND7.23［J］.Neuropharmacology,2004,46:425.
       ［6］李  葳, 姜晓钟, 赵云富. 河豚毒素不敏感型钠通道在疼痛作用机制中的研究进展［J］.上海医学, 2002, 25(10): 666.
       ［7］Waxman S G, Dib-Hajj S, Cummins T R, et al. Sodium channels and pain. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(14): 7635.
       ［8］Hiroyuki Ichikawa,Toshiyuki Itota,Yasuhiro Torii,et al.Osteocalcin-immunoreactive primary sensory neurons in the rat spinal and trigeminal nervous systems［J］.Brain Research,1999,838(1-2): 205.
       ［9］裴德安，蔺玉昌，陈  琰.膜片钳技术心肌细胞钠通道动力学研究［J］.南通医学院学报,1998,18(2):154.
       (中南民族大学生物医学工程研究所，湖北 武汉  430074)
       作者简介：张  凡(1971)，女(汉族)，河南平顶山人，现在中南民族大学电子信息工程学院生物医学工程专业学习，硕士学位，主要从事用膜片钳和电化学的方法研究中药血竭及其重成分研究工作.
       通讯作者简介：刘向明(1951)，男(汉族)，湖北荆沙人，现任中南民族大学生物医学工程研究所教授，博士学位，主要从事中药的实验研究与定量分析工作.