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       【关键词】  斑马鱼；,,血管发生素
       摘要：目的探讨血管内皮细胞生长因子和血管发生素1及其受体在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达，为构建药物筛选的在体模型提供依据。方法采用多聚酶链式反应，扩增了长约280bp的斑马鱼血管发生素1 cDNA部分序列，作为探针，以原位杂交法测定了血管内皮细胞生长因子和血管发生素1及其相应受体flk1和Tie2的表达。结果从受精卵胚胎发育第12小时可见血管内皮细胞生长因子和血管发生素1及其相应受体flk1和Tie2的表达；在受精卵胚胎发育的第16小时，血管内皮细胞生长因子和血管发生素1主要在头部和尾部胚芽表达；第24小时在眼球、视窝、中脑、后脑的腹前侧和肌节中表达，Tie2和Flk1主要在肌间背部动脉血管、躯干新生血管芽和轴向静脉中表达。结论血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其受体在斑马鱼胚胎发育早期的血管发生过程中可能相互作用，并协调血管发生过程。斑马鱼是研究胚胎发育早期微血管发生和血管发生的极佳动物模型，可用于促血管发生或抑制血管发生药物筛选。
       关键词：斑马鱼；  血管发生素1；  血管内皮生长因子；  受体
       Expressions of Angiopoietin1 and Its Receptors During  Early Development in Zebrafish
       LIU Mingzhu， ZHANG Xuewu，KOH Gouyoung， KIM Suhnhee， ZHANG Ju
       （1. School of Basic Medical Sciences, Yanbian University, 133000;  2. Korean Advanced University of Science and Technology, Daejon, R. Korea 305701; 3. Chonbuk National University Chonju, R. Korea, 560180;  4.Nankai University, Tianjin, 300071，China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin1 (Ang1), and their receptors Flk1 and Tie2 during angiogenesis and vasculogenesis in early embryo development of zebrafish. MethodsUsing homology-based polymerasechain reaction, a 280 bp of partial cDNA of zebrafish (zfAng1) was isolated. The expressions of Ang1, Tie2, VEGF and Flk1 in zebrafish were examined during up to 24 h embryonic development by whole mount in situ hybridization. ResultsThere were no detectable expressions of these genes up to 10 h postfertilization. However, there were detectable expressions of these genes at 12 h. At 16 h, Ang1 and Tie2 were expressed mainly in head and tail bud. At 24 h,  Ang1 was expressed mainly in the lens, optic cup, mesencephalon, ventral part of hindbrain, and myotomes in the somites, while zfTie2 was mainly expressed in intersomitic vessels including dorsal aorta and axial veins, and sprouting vessels from the dorsal aorta in the trunk. VEGF was expressed mainly in the lens, optic cup, mesencephalon and myotomes in the somites, while zfFlk1 was mainly expressed in intersomitic vessels including dorsal aorta and axial veins, and sprouting vessels from the dorsal aorta in the trunk. ConclusionAng1, VEGF, Tie2 and Flk1, may act cooperatively and interactively for vascular development in zebrafish during early development. Present results also suggested that zebrafish as a quality model for study on vasculogenesis and angiogenesis during embryonic development and screening for angiogenic enhancer or inhibitors.
       Key words：Zebrafish;   Angiopoietin1;   Vascular endothelial growth factor ;    Receptor
   
　　斑马鱼(zebrafish, Danio rerio) 具有世代周期短（2~3个月），雌性个体可产大量卵，形体较小，易于在有限的空间内饲育，早期胚胎发育过程血管发生过程透明便于直接观察［1］。斑马鱼还具有和其他脊椎动物相近的基因结构和调节模式［2］。 因此, 利用斑马鱼发育过程中的这些优点将有助于在体研究血管发生和微血管发生［3］。目前, 血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及其受体Flt-1在斑马鱼中的表达情况已经相对比较清楚［4，5］。但对于血管发生素1(angiopoietin1, Ang1)及其受体Tie2在斑马鱼发育过程中的表达尚不清楚。为此,我们检测了Ang1及其受体Tie2在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达情况，以期为建立促血管发生或抑制血管发生的药物筛选的动物在体模型奠定基础。
       　　1  材料与方法
       1.1  试剂除特殊标记的试剂外的其他试剂均购自 Sigma 公司。
       1.2  斑马鱼Ang1 (zebrafish Ang1，zfAng1) cDNA部分序列的分离    从受精卵发育24 h的胚胎lZAP cDNA文库 (Stratagene, USA)中以PCR和特定引物扩增出一段斑马鱼zfAng1 cDNA部分序列，引物根据包括人、小鼠和牛在内的Ang1蛋白的羧基端结构域纤维蛋白样结构域(fibrinogenlike domain)的氨基酸序列设计。 所用的引物： 5"TACAA(A/G)AA(A/G)GG(A/G)TT(C/T)GG(A/G)AATCC(AGCT)3"，与人的 Ang1蛋白的第344到第 352位氨基酸序列YKKGFGNP 相对应;  5"(TG)CA(C/T)GC(A/G)TC(A/G)AACCACCA(C/T)CC(A/G)CC3"，与人的 Ang1蛋白的第445到第452位氨基酸序列GGWWFDAC相对应。扩增条件：蛋白的第445到第 452位氨基酸序列GGWWFDAC 相对应。扩增条件：94℃ 预变性4 min，94℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 120 s，进行40个循环。扩增获得约270个碱基对的DNA片段，应用 AmpliCycle 测序，扩增的DNA克隆至PCRBlunt载体上。
       1.3  动物 斑马鱼购自Carolina Biological Supply Company  饲养于光照14 h/10 h黑暗周期，水温28.5℃ 的鱼缸中。雌雄斑马鱼的投放比例为3∶2。在给予光照后10 min 内以虹吸管收集受精卵，放置28.5℃盛有E3 培养液的平皿中孵育。
       1.4  Wholemount原位杂交用所克隆到的zfAng1 cDNA作为探针，采用PCR从斑马鱼受精卵发育24 h时相的λZAP cDNA文库中克隆得到zf VEGF的全长序列的探针。zf Tie2 探针由美国杜克大学Kevin Peters博士惠赠，zf Flk1的探针由美国卡罗林那大学Didier Stainier博士惠赠。斑马鱼的胚胎固定于焦碳酸二乙酯处理的磷酸盐缓冲液配成的4% 多聚甲醛，蛋白酶K酶解，用2 g/L的甘氨酸清洗2次，再次固定和清洗，样本在55℃ 进行预杂交和杂交，未结合的探针用RNase A (20 mg/ml)加以去除。样品用羊血清封闭后, 在碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体孵育后, 加入底物BCIP/NBT进行显色。为进行组织学检测, 标本再次用4% PFA固定、脱水、包埋在JB4包埋剂中，用Microtome (Zeiss)低温切片机制成1 mm厚切片。
       　　2  结 果
       2.1  zfAng1的cDNA 和氨基酸序列 用同源PCR法扩增得到了约 280 bp的zfAng1 cDNA片断，以此片断的DNA可编码得到含有90个氨基酸残基的zfAng1，将所得到的zfAng1 cDNA片断和人、小鼠及牛的血管生成素基因中编码纤维蛋白原结构域的核酸序列进行的多重比较具有54%~57%的同源性，由所获得的zfAng1 cDNA片断预测可能编码得到的氨基酸序列和人、小鼠及牛的血管生成素氨基酸序列比较，分别具有41%~45%的同源性。结果见图1。（相同的序列用阴影表示）
       2.2  斑马鱼的 Ang1, Tie2, VEGF和 Flk1的表达模式 应用whole mount原位杂交法对 zfAng1和zfTie2在斑马鱼受精卵胚胎发育至24 h的表达进行了测定。结果表明：到斑马鱼受精卵胚胎发育10 h为止，未检测到zfAng1和 zfTie2 的表达；在胚胎发育第12小时可检测到zfAng1在斑马鱼胚胎头部背侧和zfTie2在头部腹侧的表达； 在第16小时 zfAng1主要表达于前脑、后脑和尾芽，而 zfTie2主要表达于前脑、中脑前部和尾芽的腹前侧；至第24小时， zfAng1主要表达于眼球、视杯、中脑、后脑腹侧和肌节中的肌肉部分，而 zfTie2则极少在头部内皮侧表达，主要在包括背部动脉和腹侧静脉及躯体背动脉的芽生血管等肌间血管中表达。结果见图2。
       在斑马鱼受精卵胚胎发育至10 h未能检测到zfVEGF及其受体 Flk1的转录产物，而在第12小时可观测到zfVEGF及其受体 Flk1的转录产物的表达，这和已有的研究报道相符［5~7］。 至第24小时, zfVEGF 主要表达于眼球、视杯、中脑和肌节,而zfFlk1则主要表达于包括背部动脉、轴向静脉以及躯干背动脉的芽生部分在内的肌间血管。结果见图3。
       　　3  讨 论
       本研究表明Ang1、VEGF及其受体Tie2 和Flk1在斑马鱼早期胚胎发育过程中变化显著。这些基因不仅在血管部位表达，而且在包括眼睛在内的神经系统中表达，表明这些基因除了参与斑马鱼的血管发生过程，在斑马鱼的神经系统的发育过程中也扮演着重要的角色。
       zfTie2 和 zfFlk1在内皮细胞有着很强特异性表达。已有研究报道证实可在斑马鱼胚胎发育18 h检测到zfTie2和zfFlk1的表达，在斑马鱼受精卵发育的第30小时，可在所有内皮细胞中检测到zfTie2和 zfFlk1的表达，在斑马鱼胚胎的头部、心脏、躯干和尾部的血管内皮细胞都检测到zfTie2和zfFlk1的表达［8］。我们的研究结果表明，在斑马鱼后续胚胎发育过程中躯干背主动脉内皮细胞芽生出也可检测到zfTie2和zfFlk1的表达。因此，同哺乳动物的胚胎发育过程中一样, zfAng1和zfVEGF及其受体 zfTie2 与 zfFlk1可能在斑马鱼出生前的血管发育过程中相互协同、相互作用。本研究结果还表明, zfAng1及其受体Tie2可作为研究早期胚胎发育过程中血管发生的良好标志物，斑马鱼也是促进或抑制血管发生药物筛选的极佳的动物模型。
       　参考文献：
       ［1］Stainier DYR, Fishman MC.The zebrafishas a model to study cardiovascular development［J］. Trends Cardiovasc Med, 1994， 4：207.
       ［2］Dodd A, Curtis PM, Williams LC, et al. Zebrafish: bridging the gap between development and disease［J］.Hum Mol Genet, 2000，9： 2443.
       ［3］Serbedzija GN, Flynn E and Willett CE. Zebrafish angiogenesis: A new model for drug screening［J］.Angiogenesis, 2000, 3: 353.
       ［4］Breier G, Albrecht U, Sterrer S. et al. Expression of vascular endothelial growth factor during embryonic angiogenesis and endothelial cell differentiation［J］.Development, 1992, 114: 521.
       ［5］Liang D, Xu X, Chin AJ, et al. Cloning and characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF) from zebrafish, Danio rerio［J］. Biopchimica Biophysica Acta, 1998, 1397: 14.
       ［6］Liao W, Bisgrove BW, Sawyer H, et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation ［J］.Development, 1997, 124: 381.
       ［7］Parker LH, Zon LI and Stainier DY. Vascular and blood gene expression［J］. Methods Cell Biol, 1999, 59: 313.
       ［8］Lyons MS, Bell B, Stainier D, et al. Isolation of zebrafish homologues for the tie-1 and tie-2 endothelium-specific receptor tyrosine kinases［J］.Dev Dyn, 1998, 212: 133.
       1. 延边大学基础医学院，吉林 延吉   133000； 
       2. 韩国科学技术大学，韩国 大田  305701；
         　3. 韩国全北大学校医科大学，韩国 全州  560180； 
       4. 南开大学，天津  300071
       基金项目：教育部回国博士启动基金资助项目
       
　　教育部西部地区高等院校高级访问学者项目
       作者简介：柳明洙(1963)，男(朝鲜族)，吉林延吉人，现任延边大学基础医学院副教授，博士学位，主要从事生物化学与分子生物学教学与科研工作.