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       【关键词】  羊肚菌；,,多糖；,,抗菌活性
       　摘要：目的对羊肚菌Morchella esculenta多糖的体外抗菌活性进行初步研究。方法采用改良药基法和K-B法，对子囊果多糖(APS)、菌丝体胞内多糖(IPS)、胞外多糖(EPS)进行体外抗菌实验。结果研究表明羊肚菌多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌以及放线菌的抗菌活性都比较强，而对霉菌和酵母菌的抗菌作用不明显。结论 3种羊肚菌多糖均具有比较明显的抗细菌、抗放线菌活性。 
       关键词：羊肚菌；  多糖；  抗菌活性
       Study on Anti-microbial Activities of Polysaccharide from Morchella esculenta in vitro
       LONG Zhenghai, JI Qixiong, ZHOU Huiyan
       (Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China)
       Abstract：ObjectivePrimary study on antimicrobial activities of Morchella polysaccharide in vitro is carried on.MethodsThe MIC of polysaccharide were measured with dishmedicine-medium and KirbyBauer Method.ResultsThe test indicated that all the tested samples had anti-microbial activities agaist E.coli,B.subtilis,S.aureus and A.microflavus.ConclusionStudy showed 3 kinds of polysaccharide from M.esculenta had strong anti-bacterial and antiactinomyces power.
       Key words：Morchella esculenta；  Polysaccharide；  Antimicrobial activities
   
　　羊肚菌Morchella esculenta营养丰富，是珍稀食药用真菌。现代医学研究表明多糖是其重要的活性物质之一，具有抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒及提高机体免疫力等作用［1,2］。目前尚未见到有关羊肚菌多糖抗菌作用方面的研究报道，本文将对羊肚菌子囊果多糖以及菌丝体胞内、胞外多糖的抗菌活性进行初步研究。
       　　1  材料与方法
       1.1  菌种来源 
       1.1.1  羊肚菌来源羊肚菌M.esculenta子囊果于200505分别采自浙江丽水和贵州贵阳，同时进行单孢子分离得到斜面菌种。
       1.1.2  供试菌种
       大肠杆菌Escherichia coli，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，耐药性金黄色葡萄球菌Staphalococcus aureus，细黄放线菌Actinomyces microflavus，产黄青霉Penicillium chrysogenum，米曲霉Aspergillus oryzae，热带假丝酵母Candida tropicalis，啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae均由本校微生物教研室提供。
       1.2  培养方法和供试菌液制备
       1.2.1   培养基
       细菌培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，水100 ml，pH 7.0~7.2。真菌培养基：马铃薯20％，葡萄糖2％，水100 ml，自然pH值。酵母、放线菌培养基：葡萄糖5％，蛋白胨1％，KH2PO40.3％，MgSO40.5％，水100ml，pH6.0。
       1.2.2  供试菌培养供试菌种用各自液体培养基在适宜温度下培养后得到各种原菌液。
       1.2.3  供试菌液制备
       用原菌液分别制备成含菌量约为107 CFU/ml的供试菌液，备用。
       1.3  多糖提取与测定
       1.3.1  多糖提取
 
　　取羊肚菌子囊果干品2 g，加人100 ml水，煮沸提取30 min，冷却后2 500 r/min离心5 min。取上清液于一烧杯中，残渣再加人100 ml水，煮沸提取30 min，收集上清液于同一烧杯中，残渣再重复提取1次，将3次收集的有提取液的烧杯在电炉上加热、浓缩至30 ml左右冷却，再加人100 ml乙醇使多糖析出，沉淀30 min后2 500 r／min离心3 min，弃去上清液，残渣再加人50 ml乙醇搅拌清洗后同样离心弃上清液，残渣再清洗1次后，用约80℃热水70 ml溶解残渣，转移至200 ml容量瓶中，冷却后定容，得到子囊果多糖液(APS)。再取羊肚菌菌丝体干品2 g，同法制备成菌丝体胞内多糖液(IPS)。用真菌培养基接种羊肚菌斜面菌种在25~28℃中培养5~7 d，滤去菌丝体的液体培养液于3 600 r/min离心20 min，收集上清液。取5 ml上清液，加入3倍体积的95％的乙醇，4℃静置过夜；3 600 r/min离心10 min，收集沉淀，用60℃热水溶解，定容至200 ml，即得到胞外多糖液(EPS)。
       1.3.2  多糖含量测定
       采用蒽酮比色法［3］测定多糖含量，经测定每毫升子囊果多糖液、胞内多糖液、胞外多糖液分别含有多糖2 000，2 500，100 mg。
       1.4  体外抑菌实验 
       1.4.1  抑菌圈的测定
       采取K-B法抗菌实验［4］，用无菌棉签蘸取上述供试菌液分别均匀涂布于不同琼脂平板表面，待平板略干后，在标记位置上贴上含生理盐水及不同浓度多糖的纸片，37℃温箱培养24 h后取出，用直尺测量抑菌圈直径。平行做3次实验，取其平均值，以生理盐水做空白对照。
       1.4.2  MIC值的测定
       采用改良的药基法［5］将上述3种多糖溶液制备成100 mg/ml的供试液，过滤除菌后，按比例加入融化的M.H琼脂(酵母菌、白色念珠菌用沙氏琼脂)，混匀倒板，得到每毫升含多糖分别为：10，5，4，3，2，1，0.5，0.25，0.125 mg的含多糖琼脂平板。用微量加样器逐个点种供试菌液1μl，形成的菌液圈直径为5 mm左右，菌液干后置37℃孵育18 h，菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该多糖液对检测菌的MIC值。每个受试样平行做3次实验，以不含多糖的M.H琼脂平板作对照。
       　　2  结果与分析
       采用药基法对羊肚菌3种多糖的抗菌作用进行了研究，测定了它们对8个供试菌株的最低抑菌浓度（MIC），结果如表1所示。结果说明3种多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌以及放线菌的抗菌活性比较强，其中它们对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值范围都≤1.0，抑菌效果比较明显。然而羊肚菌多糖对产黄青霉、米曲霉等霉菌的抑菌作用较小，抗酵母的能力也较差。
       在上述实验基础上，选择比较敏感的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、细黄放线菌作为供试菌采取KB法比较了多糖浓度对抗菌效果的影响。结果见表2。实验结果与上述MIC值较为吻合。而且抑菌圈直径随着多糖浓度的增加而有所增加，当浓度达到5 mg/ml时3种多糖对各供试菌的抑制效果均比较明显。表1  羊肚菌多糖对8个供试菌株的体外抗菌作用（略）表2  羊肚菌多糖浓度对抗菌活性的影响多糖浓度（略）
       　　3  讨论
       近年来关于羊肚菌多糖的提取、分离纯化、结构鉴定、理化性质以及发酵动力学等方面的报道较多［6~8］，对其药理活性特别是体内外抗菌活性尚未见详细报道，其他真菌多糖的抗菌作用的研究也较少［9］。本文首次报道了羊肚菌多糖的体外抗菌活性，研究结果为发掘羊肚菌新的生物活性，开发新的用途提供了一定的理论依据，然而动物体内抗菌实验以及抗菌谱的筛选等工作将是有待进一步研究的重要课题。
       　参考文献：
       ［1］宋淑敏，皱作华，王洪荫，等．EF11营养液的研制及其保健作用的试验研究［J］.食品科学，1996，17（7）：52.
       ［2］胡克兴，董  雪，范  黎．羊肚菌属分子系统学研究进展［J］.微生物学通报，2004，31(6)：115.
       ［3］李  群．蒽酮比色法测定羊肚菌多糖及试验评价［J］.中国卫生检验杂志，2000，20（1）：31.
       ［4］张卓然．医学微生物实验学，第2版［M］.北京：科学出版社，1999：26.
       ［5］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1612.
       ［6］李  洁，邱德江．酶法提取羊肚茵多糖的研究简报［J］.河北林业科技，2005，1：1.
       ［7］魏  芸，张无佑，张  姝，等．羊肚菌多糖MEPSP1分离纯化及性质鉴定［J］.食用菌学报，1999，6(3)：13.
       ［8］武秋立，安家彦．羊肚菌胞外多糖发酵动力学模型［J］.南开大学学报・自然科学版，2005，38（1）：43.
       ［9］李小定，荣建华，吴谋成．真菌多糖生物活性研究进展［J］.食用菌学报，2002，9(4)：50.
       (浙江医药高等专科学校，浙江  宁波  315100)
       基金项目：浙江医药高等专科学校校内科研资助项目（No.ZPCSR2005014)
作者简介：龙正海(1963)，男(苗族)，贵州锦屏人，现任浙江医药高等专科学校制药高级工程师，硕士学位，主要从事生物制药方面的研究工作.