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       【关键词】  指纹图谱；,,三叶木通；,,川木通；,,高效液相色谱
       摘要：目的应用反相高效液相色谱（RPHPLC）建立三叶木通指纹图谱。方法Hypersil ODS柱，H2O与CH4梯度洗脱，流速：1ml/min, 柱温：20℃，检测波长：215 nm。结果建立了HPLC指纹图谱共有模式，并应用此共有模式对五叶木通和川木通进行了相似度比较。结论 三叶木通药材中各成分均得到很好分离，可作为三叶木通药材专属性指纹图谱。
       关键词：指纹图谱；  三叶木通；  川木通；  高效液相色谱
       Study on HPLC Fingerprint Chromatography of Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz
       LIU Weiguo， YANG Wenyu*
       (Agricultural College of Sichuan Agricultural University, Ya"an 625014,China)
       Abstract：ObjectiveTo apply RPHPLC to built the fingerprint of  Akebia trifoliata(Thunb)Koidz. MethodsHypersil ODS column was used, with mixtures of water and methanol as mobile phase in a gradient mode. The flow rate was 1 ml/min. The temperature of column was 20℃. The wavelength of detection was 215 nm. ResultsAfter the nutual mode of HPLC fingerprint was set up, comparison of similar degree to the crude drugs of Akebia quinata(Thunb.)Decne. and Clematis montana Buch.Ham. had been carried on. ConclusionAccording to the selected chromatographic conditions, a good fingerprint of Akebia trifoliata(Thunb)Koidz has been described. The method is simple,accurate with good reproducibility. It may be practical value for the quality control of sample for Akebia trifoliata(Thunb)Koidz.
       Key words：Fingerprint chromatography;  Akebia trifoliata(Thunb)Koidz.;  Chuan Mutong;  HPLC
   
　　木通科植物三叶木通Akebia trifoliata(Thunb)Koidz.的干燥藤茎味微苦、性寒，清热、利尿、活血通脉，有止痛、杀菌、消炎、利尿之功效，是中药木通的主要药源［1~3］。关木通用药标准被取消后，三叶木通作为药材木通已在市场上逐渐恢复使用。因此，建立木通药材有效的质量评价方法，对不同产地三叶木通的质量进行全面而系统的研究，确保其质量的稳定，直接关系到木通相关药品和临床处方的疗效。近年来，指纹图谱技术被用于中药的质量控制，其优点在于可全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例，在大多数中药有效成分尚未阐明的情况下，仍可有效地表征中药质量［4］。本文采用反相高效液相色谱法，建立三叶木通的指纹图谱，并对药材木通的主要源植物三叶木通、五叶木通进行了比较研究，同时将药材木通的典型指纹谱与川木通的指纹谱进行了比较，为木通的质量控制提供有效方法。
       　　1  器材仪器　
       Agilent1100系列高效液相色谱仪，配备紫外检测器及自动进样装置；Hypersil ODS柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，系列号USLO009043；隆达HF5.0 B超声循环提取机（北京弘祥隆生物技术开发有限公司）。试剂　甲醇（色谱纯），Fisher Scientific UK Limited；乙腈（色谱纯），Fisher Scientific UK Limited；重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。材料　13个三叶木通样品、2个五叶木通样品和2个川木通样品（表1），经四川农业大学杨文钰教授鉴定分别是木通科木通属植物Akebia trifoliate(Thunb.) Koid.，木通科木通属植物Akebia quinata(Thunb.)Decne.，毛茛科铁线莲属植物Clematis armandi Franch。
       表1  样品来源（略）
       　　2  方法
       2.1  供试品溶液的配制采自各地的三叶木通、五叶木通和川木通多年生茎，60℃烘干，粉碎过40目筛，称取5.000 g，50%乙醇50  ml、功率1 200 W超声30 min后过滤，再加50 ml超声10 min，合并提取液，70℃减压浓缩至干，加甲醇溶解并定溶至25 ml备用。
       2.2  色谱条件的确定根据提取液的紫外扫描图知三叶木通乙醇提取物在203 nm具有最大吸收，因此在此检测波长下对提取液进行了色谱条件的选择，但发现此波长下进行梯度洗脱时基线漂移严重。通过反复多次实验，最终确定的色谱条件为：流动相：甲醇A，水B，梯度洗脱程序见表2。检测波长：215 nm柱温：20℃流速：1 ml/min在以上色谱条件下的色谱图见图1。
       2.3  方法学考察取012号样品的供试品溶液分别在0，6，12，24 h和48 h检测指纹图谱。另取此溶液连续进样5次，检测指纹图谱。再另取012号样品5份，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品，检测指纹图谱。对以上指纹图谱分别用"中药指纹图谱相似度计算软件"计算各自的相似度，结果表明各色谱峰的相对保留时间和峰面积基本一致，相似度均＞0.94，RSD值均＜2%，符合指纹图谱的要求。
       表2  梯度洗脱程序（略）
       图1   三叶木通高效液相色谱图（略）
       　　3  结果
       3.1  相对保留值α对色谱峰的识别和共有峰的确定按上述方法对001~013号样做HPLC指纹图谱检测（图1），积分后得一系列含保留时间和峰面积的数据表。为了消除实验过程中每一次进样时间不一致以及样品差异所造成的保留时间的误差，要求以相对保留时间α对色谱峰进行识别。由于三叶木通三萜类皂苷化合物种类多，而且结构相似，出峰较密集，难以插入一个合适的参照物，同时因三叶木通化学成分的基础性研究较为薄弱，目前市场上尚无标准品出售，因此我们选择一个分离较好、出峰居中、保留时间为44.06左右且每个样品中都有的色谱峰作为内参峰，以样品中各色谱峰的保留时间与内参峰的保留时间的比值α（相对保留时间）对各样品的色谱峰进行识别。由于前10 min是极性较大的水溶性杂质，不是本药材的有用成分，所以将此范围内的色谱峰舍弃。我们按照“80%以上样品所共有的峰为三叶木通药材的共有峰”的原则，设定归并色谱峰的窗口范围为1%，对13个药材样品的所有峰进行共有峰的筛选，并对每个特征指纹峰求取其面积归一化值列表，其结果如表3。从表3可以看出，13个三叶木通材料的19个共有峰α值的标准偏差极小，是鉴定本药材的必要条件，其平均α值分别为：0.276， 0.290，0.310，0.350，0.375，0.429，0.481， 0.533，0.677，0.827，0.842， 0.857， 0.882， 0.904，0.917，1.000， 1.013，1.032，1.086。
       3.2  三叶木通高效液相色谱标准指纹谱（HPLCFPS）以表3为依据，所有参与药材样品为对象，将每个特征指纹的保留值和其峰面积的均值列表，即得三叶木通的标准指纹谱（表4），它们将成为我们比较鉴定三叶木通的依据。
       表3  三叶木通高效液相色谱图共有峰相对保留值（略）
       α  ：相对保留时间，AT：相对峰面积
       表4  三叶木通的高效液相色谱标准指纹谱（略）
       3.3  三叶木通标准指纹谱实用性检验应用“中药指纹图谱相似度计算软件”，以三叶木通HPLCFPS为模板，计算相同色谱条件下三叶木通与五叶木通（014，015）、川木通（016，017）指纹图的相似度。结果表明，三叶木通与五叶木通的相似度为76%，与川木通的相似度为34%，说明川木通与三叶木通的成分相差较大。
       　　4  讨论
       通过对三叶木通不同提取溶剂、提取方法(包括超声、回流提取)和液相色谱条件（柱温、流动相的组成、流速）等方面的考察，确定了以上供试品的制备方法和色谱条件。木通科三叶木通作为中药木通恢复使用后，为避免再次出现药源混乱的局面，急需一种确实可行的方法来对其原植物种类及真伪进行鉴定。目前没有文献报道有关三叶木通指纹图谱的研究。本文按照国家药典委员会关于“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)的通知” ［4］，以HPLC梯度洗脱法对三叶木通药材进行了指纹图谱研究，实验证明，该方法可操作性强、重现性好，能将三叶木通中的成分较好的分离，同时对指纹谱特征峰进行了识别，建立了三叶木通标准指纹谱。此谱能较好的体现不同产地三叶木通的共同特征，可以为药源鉴定和质量的分析与控制提供可靠依据，并为本药材的进一步研究打下了基础。
       　　参考文献：
       ［1］  中国医学科学院药物研究所.中药志，第3卷［M］.北京：人民卫生出版社，1981：563.
       ［2］  《中国药物大全》编委会.中国药物大全・中药卷，第2版［M］.北京：人民出版社，1988：208.
       ［3］  马红梅，张伯礼.不同科属木通比较［J］.中国中药杂志，2002，27(6):412.
       ［4］  国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［J］.中成药，2000，22(10):671.
       (四川农业大学农学院，四川 雅安  625014)