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       【关键词】  何首乌；,,培养心肌细胞；,,缺氧；,,超氧化物岐化酶；,,丙二醛；,,组织化学
       摘要：目的观察何首乌对培养心肌细胞缺氧性损伤的影响。方法将Wistar系大鼠乳鼠心肌细胞原代单层培养5 d，建立“缺氧”损伤模型，通过生化检测及组织化学等方法，研究何首乌对缺氧培养心肌细胞的保护作用。结果实验组及对照组心肌细胞PAS反应和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性明显增强而酸性磷酸酶（ACP）活性减弱；实验组及对照组超氧化物歧化酶（SOD）活性较模型对照组增强而丙二醛（MDA）含量明显降低（P＜0.01）。结论何首乌对缺氧心肌细胞具有良好的保护作用。
       关键词：何首乌；  培养心肌细胞；  缺氧；  超氧化物岐化酶；  丙二醛；  组织化学
       Experimental Study on the Protective Effects of Fleeceflower Root to the Anoxic Cultured Cardiac Muscle Cells
       JIN Xiongzhe，JIN Zheng
       （Sports College of Yanbian University,Jilin Yanji,133000,China;Medical Science College of Yanbian University,Jilin Yanji,133000,China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effects and mechanism of Fleeceflower Root to the cultured anoxic damnification cardiac muscle cells. MethodsThe cardiac muscle cells of wistar suckling rats were cultured for 5 days, and was  an anoxic set up injured model to investigate the protective effects of Fleeceflower Root on the cultured anoxic damnification cardiac muscle cells by means of biochemical testing, histochemistry and so on.ResultsIn the normal group, PAS reaction of cardiac muscle cells and the activity of SDH increased while the activity of ACP decreased; Compared to the normal group, the activity of SOD was strong in the cells of the model control group and the content of MDA increased significantly(P<0.01).ConclusionThe results prove that Fleeceflower Root possesses very good protective and anti-oxidation effects to the anoxic cardiac cell.
       Key words：Fleeceflower Root；   Cultured cardiac muscle cell；  Anoxia；   SOD；  MDA；   Histochemistry
   
　　何首乌又称首乌、赤首乌，是蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，其化学成分主要有卵磷脂、羟基蒽醌类化合物（主要为大黄素、大黄酚、大黄酸等葡萄糖苷）、二苯乙烯苷类及微量元素钙、铁、锌、锰、铜等［1］。何首乌具有补肝、益肾、养血、祛风的作用，主治肝肾阴亏、发须早白、血虚头晕、腰膝软弱、筋骨酸痛、遗精崩带、久疟、久痢、慢性肝炎、痛肿等病症［2］。          何首乌对在体缺血再灌注心肌细胞具有保护作用［3］，但其对体外缺氧培养心肌细胞等方面的研究，国内外尚未见报道。本实验利用培养心肌细胞模拟心肌缺血再灌注损伤模型，应用生化检测及组织化学等研究方法，探讨了何首乌对培养心肌细胞缺氧性损伤的保护作用及其作用机理，为何首乌的临床应用提供理论依据。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物Wistar系大鼠乳鼠，3~5 d龄，50只，由延边大学医学院实验动物科提供。
       1.2  药品取何首乌块根1 000 g，加蒸馏水2 000 ml浸泡1 h。100℃煮沸2 h，过滤。再加蒸馏水2 000 ml煮沸1 h，过滤。将两次过滤液在80℃水浴下浓缩成浸膏，在70℃温箱中烘干、粉碎，备用。
       1.3  试剂 人参总皂苷由延边大学天然植物制品研究所提供；RPMI Medium1640培养基为GIBCO公司产品；胰蛋白酶为DIFCO公司产品；新生灭活小牛血清为北京华美生物工程公司产品；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。
       1.4  仪器超净工作台为上海净化设备厂产品；USA二氧化碳培养箱；日本OLYMPUS 倒置相差显微镜；德国ZK15型超低温离心机；芬兰MK3型酶标仪；CSS200型超声波粉碎机为山东济宁无线电仪器厂产品。
       1.5  方法
       1.5.1  心肌细胞的原代单层培养 心肌细胞的培养采用姜玉顺等［4］建立的原代单层培养方法。
       1.5.2  培养心肌细胞"缺氧"损伤模型的制备 将生长良好的培养心肌细胞的培养基倒掉，以预先饱和纯氮气（99.99%）40 min的N2饱和缺氧培养基冲洗2次，取N2饱和缺氧培养基3 ml加入培养瓶中，同时向瓶内充氮气10 s以置换瓶内空气，置于37℃二氧化碳培养箱中，12 h后备用。
       1.5.3  分组及处理取生长良好的培养瓶36瓶随机分为4组：正常组、模型组、对照组及实验组。正常组更换正常培养基培养；模型组更换N2饱和缺氧培养基培养；对照组为N2饱和缺氧培养基加0.5 mg/ml人参皂苷共培养；实验组为N2饱和缺氧培养基加5 mg/ml何首乌提取物共培养。将各组均置于37℃二氧化碳培养箱内培养12 h。
       1.5.4  生化检测实验各组各取6瓶测定SOD活性和MDA含量。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，采用TBA法测定MDA含量， SOD活性和MDA含量的测定严格按照试剂盒操作程序进行。
       1.5.5  组织化学观察实验各组各取3瓶做组织化学染色。取出各组培养瓶内的生长细胞盖玻片，进行PAS反应显示糖原，用酶组织化学方法显示SDH及ACP。经上述染色后用OLYMPUS万能显微镜观察并拍片分析。
       1.5.6  数据处理 各组数据均采用SPSS11.0统计软件进行方差分析。
       2  结果
       2.1  生化检测结果
       2.1.1  何首乌对缺氧培养心肌细胞SOD活性的影响实验组及对照组心肌细胞SOD活性明显高于模型组（P＜0.01），说明何首乌能有效提高心肌细胞SOD活性，以清除超氧阴离子自由基保护培养心肌细胞免受缺氧损伤。结果见表1。
       表1  何首乌对缺氧培养心肌细胞SOD活性的影响（略）
       * 与模型组相比较,P＜0.01
       2.1.2  何首乌对缺氧培养心肌细胞MDA含量的影响模型组心肌细胞MDA含量明显高于正常组，实验组及对照组心肌细胞MDA含量明显低于模型对照组（P＜0.01），说明缺氧可引发脂质过氧化作用，损伤心肌细胞，但何首乌对心肌细胞受自由基攻击有一定的防护作用。结果见表2。
       表2  何首乌对缺氧培养心肌细胞MDA含量的影响（略）
       * 与模型组相比,P＜0.01
       2.2  组织化学观察结果在倒置相差显微镜下观察各组心肌细胞，正常组的心肌细胞数量多，细胞突起较长，相互交织成簇生长，可见规律或不规律性的有力搏动；模型组的心肌细胞数量明显减少，细胞突起细短，细胞散在分布，搏动次数明显减少且微弱无力；实验组及对照组与模型组相比心肌细胞数量明显增多，细胞突起较粗长，仍可见成簇生长的心肌细胞团，搏动次数明显增多且有力，部分接近正常对照组水平。
       2.2.1  何首乌对缺氧培养心肌细胞糖原含量的影响用PAS法显示心肌细胞糖原，正常组心肌细胞PAS反应强，细胞质内紫红色的糖原颗粒含量丰富，分布较均匀，糖原颗粒界限较清楚，染色深（图1）；模型组心肌细胞PAS反应明显减弱，细胞质内糖原含量明显减少，糖原颗粒分布稀疏，甚至缺失，糖原颗粒界限不清，染色浅（图2）；实验组及对照组心肌细胞PAS反应均比模型对照组明显增强，细胞质内糖原颗粒明显增多，染色较深，但其糖原颗粒分布与正常组相比不是很均匀，界限也较模糊，而且实验组心肌细胞比对照组心肌细胞PAS反应强些（图3）。
       2.2.2  何首乌对缺氧培养心肌细胞SDH活性的影响正常组心肌细胞SDH活性较强，细胞质内蓝紫色颗粒较多，染色较深（图4）；模型组心肌细胞SDH活性明显减弱，细胞质内蓝紫色颗粒明显减少，分布稀疏，染色较浅（图5）；实验组及对照组心肌细胞SDH活性与模型对照组相比明显增强，细胞质内蓝紫色颗粒明显增多，染色较深（图6）。
       2.2.3  何首乌对缺氧培养心肌细胞ACP活性的影响正常组心肌细胞ACP活性较弱，细胞质内棕黄色颗粒较少，染色浅（图7）；模型组心肌细胞ACP活性明显增强，细胞质内棕黄色颗粒明显增多，染色深（图8）；实验组及对照组心肌细胞ACP活性与模型组相比明显减弱，细胞质内棕黄色颗粒较少，染色较浅（图9）。
       图1  正常组PAS反应×200（略） 
       图2   模型组PAS反应×200（略）
       图3  实验组PAS反应×200 （略）
       图4  正常组SDH活性×200（略）
       图5  模型组SDH活性×200（略）  
       图6  实验组SDH活性×200（略）
       图7  正常组ACP活性×200（略） 
       图8  模型组ACP活性×200（略）
       图9  实验组ACP活性×200（略）
       　　3  讨论
       心肌细胞在缺氧条件下，会出现一系列的变化，包括形态学、活动功能、细胞代谢改变及胞浆酶自细胞内漏出等［5］。尤其是自由基性质活泼，具有极强的氧化反应能力，对人体有很大的危害性。自由基可引发多价不饱和脂肪酸过氧化而生成过氧化脂质（LPO），其最终产生的丙二醛（MDA）能使蛋白质、核酸、脂类发生交联，使生物膜发生变性，导致细胞结构改变、功能破坏而引起癌症、衰老及心血管退变性疾病［6］。SOD为直接清除自由基的酶，可阻断自由基促使产生LPO的链式反应，从而保护细胞不受自由基的损害。本实验生化检测MDA含量及SOD活性结果：模型组心肌细胞MDA含量明显高于正常组，而SOD活性明显低于正常组，提示体外培养心肌细胞在缺氧损伤下自由基增多，脂质过氧化作用增强，而SOD消耗过多，不能有效清除氧自由基，对抗脂质过氧化作用。实验组心肌细胞SOD活性明显增高，与模型组相比P＜0.01；MDA含量明显减少，与模型组相比P＜0.01，说明何首乌可提高心肌细胞SOD的活性，清除自由基，并抑制脂质过氧化作用，有研究表明何首乌中的二苯乙烯苷类成分具有较强的体外抗氧化能力和清除活性氧作用，是一种较强的抗氧化剂［7］。提示何首乌可能是通过清除氧自由基及抗脂质过氧化等作用途径防止缺氧损伤对心肌细胞的损害。正常情况下，心肌主要靠有氧代谢供能，而缺氧后，能量主要由糖酵解供应，这样有氧氧化被抑制，糖酵解增强，首先加快了肌糖原的酵解，心肌糖原含量显著下降。本实验应用PAS法显示心肌细胞糖原，正常组心肌细胞PAS反应强，细胞质内紫红色的糖原颗粒含量丰富，分布较均匀，糖原颗粒界限较清楚，染色深；模型对照组心肌细胞PAS反应明显减弱，细胞质内糖原含量明显减少，糖原颗粒分布稀疏，甚至缺失，糖原颗粒界限不清，染色浅；实验组及对照组心肌细胞PAS反应均比模型组明显增强，细胞质内糖原颗粒明显增多，染色较深，但其糖原颗粒分布与正常组相比不是很均匀，界限也较模糊，而且实验组心肌细胞比对照组心肌细胞PAS反应强些。本实验结果提示：何首乌能促进糖原合成，抑制糖酵解，从而减少糖原分解，也能一定程度上纠正缺氧心肌细胞糖酵解过盛所致的细胞内酸中毒。SDH主要存在于细胞线粒体的内膜上，是细胞线粒体进行有氧氧化的系列酶之一［8］。缺氧使有氧氧化受到抑制，线粒体的功能随之减退，导致SDH活性降低。本实验正常组心肌细胞SDH活性较强，细胞质内蓝紫色颗粒较多，染色较深；模型组心肌细胞SDH活性明显减弱，细胞质内蓝紫色颗粒明显减少，分布稀疏，染色较浅；实验组及对照组心肌细胞SDH活性与模型组相比明显增强，细胞质内蓝紫色颗粒明显增多，染色较深。本实验结果提示何首乌能够改善缺氧心肌细胞的能量代谢，使心肌细胞处于功能活跃状态。ACP属于细胞内溶酶体标志酶。本实验正常组心肌细胞ACP活性较弱，细胞质内棕黄色颗粒较少，染色浅；模型组心肌细胞ACP活性明显增强，细胞质内棕黄色颗粒明显增多，染色深；实验组及对照组心肌细胞ACP活性与模型组相比明显减弱，细胞质内棕黄色颗粒较少，染色较浅。提示何首乌能够明显改善溶酶体膜的稳定性，保护心肌细胞的膜性结构，稳定细胞膜。综上所述，本实验研究表明何首乌能抑制心肌细胞超氧自由基的生成，提高清除自由基的能力，减缓心肌细胞受自由基的攻击，避免了脂质过氧化反应对心肌细胞的损害，明显地改善了缺氧对心肌细胞的损伤，有效地保持了缺氧培养心肌细胞内膜性结构的完整性，从而达到保护心肌细胞免受缺氧损伤的目的。
       　　参考文献：
       ［1］  李建北，林  茂.何首乌化学成分的研究［J］.中草药，1993，24(3):115.
       ［2］  江苏新医学院.中药大辞典，上册［M］.上海：上海人民出版社，1977：1135.
       ［3］  戴友平，唐国华，郭衍坤.何首乌提取液对犬心肌缺血再灌注损伤的预防作用实验研究［J］.中国生物药物杂志，1998，19(2):7941.
       ［4］  姜玉顺，金鹤松，文永植，等.体外培养心肌细胞的初步观察［J］.延边医学院学报，1982，5(2):75 .
       ［5］  Deluca M,  Toanne S ingnall and John A B.  Biochemical responses of myocardial  Cells in culture to oxygen and glucose deprivation［J］.Biochem Biophys Res Commun.1974，59:749.
       ［6］  刘诗平，陈尚猛，朱卫东.槲皮素及其衍生物的生物活性研究迅展［J］.中草药，1991，22(4):182.
       ［7］  刘厚淳，陈万生.何首乌水溶性成分2，3，5，4"四羟基二苯乙烯20βD葡萄糖苷的体外抗氧化作用研究［J］.药学实践杂志，2000，18(4): 232.
       ［8］  韩旭光，吴江声.小鼠实验性腹膜炎期间腹腔巨噬细胞的组织学和组织化学观察［J］.北京医科大学学报，1988，20(3):178 .
       (延边大学体育学院，吉林 延吉  133000 ；延边大学医学部，吉林 延吉  133000)