文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【关键词】  Troglitazone
        摘要：目的：探讨Troglitazone对小鼠I型葡萄糖载体(mGLUT1)表达的影响。方法：采用分子克隆技术，将过氧化物酶体增殖物受体γ(PPARγ)和维甲酸类受体X(RXRα)及 mGLUT1 cDNA分别克隆到表达载体pCMX和pGL3b上。PPARγ与RXRα及mGLUT1克隆载体转染NIH 3T3细胞，处理或不处理Troglitazone，应用荧光素酶活性测定法及RNA印迹等方法测定Troglitazone对mGLUT1重组体荧光素酶活性调节及对mRNA表达的影响。结果：Troglitazone可激活mGLUT1重组体荧光素酶的活性，并且可增加mGLUT1的mRNA表达水平。结论：Troglitazone可增强mGLUT1的表达，可能参与PPARγ对mGLUT1的调节过程。
        关键词：Troglitazone；小鼠Ⅰ型葡萄糖载体；mRNA表达
        Effect of Troglitazone on Mouse Glucose Transporter I(mGLUT1) Expression
        LI Tianzhu, LIU Mingzhu
        (Medical College, Yanbian University， Yanji 133000, China)
        Abstract:Objective:To understand the possibility of effect of troglitazone on mGLUT1 expression.Methods:PPARγ , RXRα and mGLUT1 cDNA clone into pCMX and pGL3b expression vector. The recombinant DNA transfected into NIH 3T3 cells, treated trogiltazone and confirm the mGLUT1 activity and mRNA expression by the trogiltazone through PPARγ activation with luciferase assay and Northern blot.Results:Troglitazone activates the mGLUT1 activity and increase the mGLUT1 mRNA expression through PPARγ activation. Conclusion:Troglitazone binds to PPARγ and activates mGLUT1 expression.
        Key words:Troglitazone;mGLUT1;mRNA expression
        小鼠I型葡萄糖载体(mGLUT1)在脂肪、肌肉等多种组织中表达，参与葡萄糖的代谢过程。据报道，GLUT1在多种病理状态下有较高水平的表达，但机理不清楚。Troglitazone作用靶点是一种核转录因子，即过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ，PPARγ和配体结合而激活后，与维甲酸类受体X(RXRα)形成二聚体，再结合于PPARs反应元件(PPRE)上而发挥转录调控作用。PPRE存在于许多与糖代谢与脂类代谢相关的蛋白质中。为了探讨Troglitazone 通过激活PPARγ是否参与mGLUT1的表达调节过程，本实验利用分子克隆技术构建PPARγ，RXRα和mGLUT1的表达载体系统，将其转染NIH 3T3细胞后处理Troglitazone，通过荧光素酶活性测定和Northern blot等实验方法观察Troglitazone对mGLUT1的活性调节及对mRNA 表达调节。
           1材料和方法
        1.1材料胰岛素购自 SigmaAldrich 公司(St. Louis, MO, USA)；NIH 3T3 细胞株购自 ATCC；pCRⅡTOPO 载体(LifeTechnologies, Gaithersburg, MD, USA)；Dulbecco`s modified Eagle`s 培养液 (DMEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)；层析柱(Qiagen,Hilden,Germany)；LipofectAMINE PLUS试剂 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)；OPTIMEN I(Life Technologies, Gaithersburg,MD, USA)；裂解缓冲液 (Promega,Madison,WI, USA)；荧光素酶测定试剂 (Promega,USA)；TRIzol○   R试剂 (Life Technologies, Gaithersburg，MD，USA)；Superscript II 反转录酶(Life Technologies, Gaithersburg，MD，USA。
        1.2方法
        1.2.1重组体的构建 mGLUT1启动子的 5" 侧翼1227碱基区间利用两对引物(上游引物： 5"GAC TGA ATT TGT GAA3"，下游引物：5"TCG AAG CTC TAG CTG TGC3")用PCR扩增后将扩增片段插入到 pCRⅡTOPO 载体。 pCRⅡmGT11227用 KpnI/EcoRI内切酶内切后将片段亚克隆到KpnI/EcoRI内切的 pGL3b 载体,构建重组体pmGT1。用相同的方法构建重组体 pCMXPPARγ (Pg), pCMXRXRα (Ra)。利用DNA 碱基序列测定法确定重组体的序列。
        1.2.2瞬间转染方法及荧光素酶活性测定 质粒DNA利用层析柱提取纯化。细胞培养直至细胞密度达到1×106细胞/孔。 细胞经过20 h培养吸附过程后，利用LipofectAMINE PLUS试剂进行转染。3 h后更换培养液DMEM,同时在实验组培养液中添加Troglitazone(1 μg/ml)，细胞继续培养18 h，然后用裂解缓冲液裂解细胞，经离心沉淀除去细胞沉淀后收集上清夜并进行荧光素酶活性测定。蛋白定量用Bradford 法测定。荧光素酶活性和裂解液的蛋白浓度之比用作荧光素酶相对活性。每个转染实验都进行三组3次实验。
        1.2.3RNA印迹法从实验组和对照组的NIH 3T3 细胞中提取总RNA 利用TRIzol○   R试剂。20 μg总RNA 在含有5%甲醛的1%变性琼脂糖中进行电泳，然后将RNA 转移到尼龙膜上并UV交联。尼龙膜在杂交缓冲液中进行预杂交，然后在65℃下与mGLUT1探针2 h杂交。杂交完毕后尼龙膜在37℃下用2×SSc，0.1%SDS(高盐洗液)15 min 2次冲洗，然后用0.2×SSc，0.1%SDS(低盐洗液)冲洗。 冲洗后尼龙膜放置在胶片下，－70℃过夜。18S 和 28S RNA 作为对照。
        1.3统计学处理转染实验都进行3次独立的实验，每一次都进行三组转染实验。数据用均数±标准差表示，并用t检验分析。
           2结果
        2.1 Troglitazoen在NIH 3T3 细胞中激活mGLUT1活性    为了确定Troglitazone是否能够调节mGLUT1活性，mGLUT1和PPARγ及RXRα重组体共转染NIH 3T3细胞，3 h后更换培养液DMEM,同时在实验组培养液中添加Troglitazone(1μg/ml)，细胞继续培养18 h，测定troglitazone对mGLUT1活性的影响。结果表明，pmGT1的活性在PPARγ和RXRα的作用下可部分增加，在相同条件下处理Troglitazone、pmGT1活性可增加3倍，说明Troglitazone可激活mGLUT1 的活性。见图1。
        2.2NIH 3T3 细胞中Troglitazone可调节mGLUT1 mRNA 表达 转染pCMX， PPARγ、RXRα， PPARγ、RXRα并处理Troglitazone的RNA印迹法。实验结果均显示在in vivo条件下，Troglitazone可增加mGLUT1 mRNA的表达。见图2。
           3讨论
        Troglitazone作为一种口服药物对降低血糖有比较好的疗效。这类药物的作用靶点是一种核转录因子，即过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)［1］，其亚型PPARγ(1，2型)是一类核转移因子，PPARγ和配体结合而激活后,与维甲酸类受体X(RARα)形成二聚体，再结合于PPARs反应元件(PPRE)上而发挥转录调控作用。PPRE存在于许多与糖代谢与脂类代谢相关的蛋白质中［2］。现已证明PPARγ和RXRα以异二聚体形式结合在Ⅱ型葡萄糖载体(GLUT2)和葡萄糖激酶(GK)启动子的PPRE上，促进此两种酶的表达，快速吸收葡萄糖及分解葡萄糖，进而达到降低血糖的目的［3，4］。当PPARγ和其配体结合后这种效果更为显著。Troglitazon是PPARγ的选择性激活剂，不仅可以通过激活PPARγ而降低血糖，并可增强胰岛素敏感性，对II型糖尿病有较好的疗效。
        图1不同条件下mGLUT1（略）
        GLUT1可在生物体的多组织中表达。有研究报道在3T3L1脂肪细胞和L6肌肉细胞中处理胰岛素可引起GLUT1在这些组织中表达并且可使葡萄糖达到体内稳态［5，6］。进一步的研究结果表明GLUT1虽然在动物糖尿病模型和糖尿病患者的组织的表达不十分明显，但胰岛素处理后GLUT1 mRNA的表达水平有明显的提高［7］。为了观察Troglitazone对mGLUT1表达的影响，本实验通过DNA克隆，转染，荧光素酶活性测定及RNA印迹法等实验测定mGLUT1的活性及mRNA的表达，实验证明Troglitazone可以提高mGLUT1的活性，并可以使mGLUT1的 mRNA表达增高。根据以上结论，可以得出Troglitazone可增加mGLUT1的表达，可能提高胰岛素对mGLUT1的调节，并导致生物组织中的葡萄糖稳态。
           参考文献：
        ［1］Lehmann JM, Morre LB, SmithOliver TA. An antidiabetic thiazolidinedion is a high affinity ligand for peroxisome proliferatoractivated receptor γ［J］. J Biol Chem， 1995，  270(22):1295312956.
        ［2］ELack AK, Hamm JK, Pilch PF. Reconstitution of insulinsensitive glucose transport in fibroblasts requires expression of both PPAR gamma and CEBP alpha［J］. J Biol Chem，1999，274(12):79467951.
        ［3］Hail Kim, Jaewoo Kim, Seokhyun Kim, Jiyoung Cha, Kyungsup Kim, and Yongho Ahn.Identification and Functional Characterization of the Peroxisomal Proliferator Response Element in Rat GLUT2 Promoter［J］.DIABETES，2000，49(9): 15171524.
        ［4］Soyoun Kim, Hail Kim, SangKyu Park, Seungsoon Im, Tianzhu Li, Hyae Gyeong Cheon, and Yongho Ahn.Liver Glucokinase Can Be Activated by Peroxisome ProliferatorActivated Receptorγ［J］.DIABETES，2004，53(S1):S66S70.
        ［5］FloresRiveros JR, McClenithan JC, Ezaki O, Lane MD. Insulin downregulatesexpression of the insulinresponsive glucose transporter(GLUT4)gene:effects on transcription and mRNA turnover［J］. Proc Natl Acad Sci USA ，1993，90:512516.
        ［6］Pai J, Guryev O, Brown MS, Goldstein JL.Differential Stimulation of Cholesterol and Unsaturated Fatty Acid Biosynthesis in Cells Expressing Individual Nuclear Sterol Regulatory   Elementbinding Proteins［J］.J Biol Chem， 1998， 273: 2613826148.
        ［7］Pardridge WM, Triguero D, Farrell CR. Down regulation of blood-brain glucose transporter in experimental diabetes［J］.Diabetes， 1990，39:10401044.
        (延边大学医学院，吉林 延吉133000)