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       【关键词】  多糖
        摘要：目的：纯化桑叶多糖并测定其含量。方法：采用10%三氯乙酸、大孔树脂初步纯化桑叶多糖，采用硫酸－蒽酮法对其含量进行测定。结果：用三氯乙酸除蛋白的方法是可行的；桑叶中多糖的平均含量为2.62%，平均回收率为98.81%，RSD为2.08%。结论：该法可作为桑叶中多糖的含量测定方法。
        关键词：桑叶多糖；提取纯化；硫酸蒽酮法
        Purification and Determination of Polysaccharide in Morus alba L.
        OUYANG Zhen, CHANG Yu, LI Yonghui, CHEN Jun
        (Parmaceutical Engineering Dep. of Biology and Environment Engineering School, Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212013, China)
        Abstract:Objective:To purify and determine the contents of polysaccharide in Morus alba L.Methods:The polysaccharide were preliminarily purified by 10% trichloroacetic acid and resin. The contents of polysaccharide were determined by sulfuric acid anthrone method and detected at 620 nm by UV/Visible spectrophotometry.Results:The average contents of polysaccharide in Morus alba L. was 2.62%. The recovery rate was 98.81% with 2.08% of RSD(n＝5).Conclusion:The sulfuric acid anthrone method is reasonable.
        Key words:Morus alba L;Polysaccharide;Purification;Sulfuric acid anthrone
        桑叶为桑科Moraceae植物桑Morus alba L.的干燥叶。始载于《神农本草经》，味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏风清热、平肝明目的功效；历代中医药书籍中记载桑叶能够治疗消渴症，现代药理研究表明桑叶有效成分之一桑叶多糖具有显著的降血糖作用。本实验采用三氯乙酸除蛋白、大孔树脂、活性炭脱色等一系列步骤初步纯化桑叶多糖，最后采用硫酸蒽酮法对桑叶多糖的含量进行了测定。
           1材料、仪器及试剂
        1.1原料桑叶：5月采自江苏大学桑树种植园，经镇江市药检所主任药师陈黎鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶。
        1.2仪器及试剂UV2102PCS型紫外分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)，SHB－111循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，台式冷冻高速离心机TGLL－18K(江苏太仓华美生化仪器公司)，R－200旋转蒸发仪(Buchi公司)，METTLERAE240分析天平(上海托利多－梅特勒仪器有限公司)
95%乙醇、蒸馏水、蒽酮、硫酸及其他试剂均为分析纯，葡萄糖对照品(分析纯)AB－8型大孔树脂(购于天津南开大学)。
           2方法与结果
        2.1桑叶多糖的提取称取干燥的桑叶粗粉50 g，加入10倍重量的蒸馏水，沸水浴浸提1 h，过滤，滤渣再加8倍重量蒸馏水提取1 h。合并2次滤液，减压浓缩至约120 ml，以10 000 r/min，14℃高速离心10 min后除去沉淀，得桑叶多糖提液。
        2.2桑叶多糖的纯化
        2.2.1三氯乙酸脱除蛋白质
        2.2.1.1三氯乙酸加入量的选择取桑叶粗提液分别置于6支试管中，每管6 ml。在每支试管中分别加入10%三氯乙酸0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml，静置24 h后，以10 000 r/min，14℃高速离心10 min，倾去上清液，沉淀干燥后称重。结果表明在每6 ml提取液中加入0.5 ml 10%三氯乙酸时蛋白质沉淀量最大。10%三氯乙酸加入量与蛋白质沉淀量的曲线关系如图1。
        图1不同加入量的三氯乙酸对蛋白质沉淀的影响（略）
        2.2.1.2脱除蛋白采用10%三氯乙酸脱蛋白，根据上述2.2.1.1结果，试剂与提取液体积比为1∶12，每次试剂与提取液混匀后，冷藏静置24 h，高速离心10 min，弃去沉淀，上清液浓缩至一定体积后，用95%乙醇沉淀使含醇量达80%，于冰箱冷藏静置48 h后，滤取沉淀，得桑叶粗多糖。
        2.2.2大孔吸附树脂纯化桑叶粗多糖加水溶解，上AB8型大孔吸附树脂柱，以蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入 95%乙醇无沉淀为止。将洗脱液浓缩至一定体积，得精制多糖提取液。
        2.2.3活性炭脱色精制多糖提取液，加入活性炭(固液比为1∶5)80℃脱色约2 h，趁热过滤，滤液浓缩至小体积后加入95%乙醇使含醇量达到80%，静置后抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮反复洗涤多次，60℃以下温度干燥，得到白色无定形粉末。
        2.3桑叶多糖的含量测定
        2.3.1标准溶液的制备精密称定干燥至恒重的葡萄糖对照品11.46 mg，置于100 ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，配成0.114 6 mg/ml的储备液。分别精密吸取储备液1，2，3，4，5 ml置10 ml容量瓶中，以蒸馏水稀释定容摇匀，得系列对照品溶液。
        2.3.2蒽酮硫酸试液的配制称取0.2 g蒽酮，加100 ml浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇匀置于冰箱中(现配现用)。
        2.3.3标准曲线的绘制精密称取上述系列对照品溶液1 ml，置10 ml具塞试管中，冰水浴5 min，加入0.2%硫酸蒽酮试液4 ml，立即置于沸水浴加热15 min，取出用冷水冷却至室温，室温放置10 min左右，于620 nm处测定吸收度。另精密吸取蒸馏水1 ml，同法操作，作空白对照。吸收度依次为0.094，0.165，0.225，0.301，0.356。以吸收度(Y)对葡萄糖的含量(X)回归，得回归方程Y=5.759 2X＋0.030 2,r=0.999 005。表明在11.46～57.3 μg范围内葡萄糖的含量与吸收度呈良好线性关系。如图2。
        图2标准曲线（略）
        2.3.4样品溶液的制备精密称取干燥至恒重的桑叶多糖白色无定形粉末20.8 mg，置于10 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀得多糖样品溶液，浓度为2.08 mg/ml。
        2.3.5精密度实验精密吸取样品溶液1 ml，分别置于10 ml具塞刻度试管中，按照2.3.2项下方法测定吸收度，以吸收度计算其多糖含量。结果表明RSD=2.69%(n=5)。
        2.3.6稳定性实验精密吸取样品溶液，每隔30 min测定1次吸收度，连续4 h考察其稳定性。结果表明，样品溶液在4 h内显色稳定，可进行测定，RSD=4.78%.
        2.3.7回收率测定根据2.3.4项下的结果计算，得样品中多糖的平均含量为2.76%(质量分数)。精密吸取该样品溶液1 ml，精确加入葡萄糖对照品溶液0.5 ml，按照2.3.2项下方法测定吸收度，计算回收率。结果见表1。
        表1多糖回收率实验对照品（略）
        2.3.8样品的含量测定精密吸取各样品溶液1 ml，置于10 ml具塞刻度试管中，按照2.3.2项下方法测定吸收度。用回归方程计算各样品中多糖的含量为2.62%，RSD=2.94%(n=5)。
        表2样品含量测定结果（略）
           3讨论
        3.1多糖沉淀中的主要杂质为色素、植物蛋白质。蛋白质的去除方法有盐析法、等电点沉淀法、加热变性法、有机溶剂变性萃取法、膜过滤法。加热变性法不能完全除去蛋白，等电点沉淀法要求操作精细，单一等电点不能满足除尽蛋白的目的，膜过滤法费时。并根据文献报道，三氯乙酸除蛋白效果较好，因此本实验采用三氯乙酸去除蛋白的方法，并得到良好的效果。加三氯乙酸去除蛋白质的原理：蛋白质在酸性条件下带正电荷，与三氯乙酸的酸根结合形成沉淀。
        3.2本实验中采用三氯乙酸去除蛋白，利用大孔树脂对多糖和黄酮类等杂质成分吸附力不同的特点，对多糖进行纯化，最后用活性炭吸附植物色素，获得比较纯净的多糖。所得多糖在UV200 nm有最大吸收，220 nm以上无吸收。对AB8大孔吸附树脂吸附纯化桑叶多糖的性能研究另文发表。
        3.3硫酸蒽酮比色法测定桑叶多糖的原理是桑叶多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛衍生物，然后与蒽酮缩合为有色化合物，在620 nm处有特征吸收。本法简单，显色稳定，灵敏度高，重现性好。
           参考文献：
        ［1］赵骏，钟蓉，王洪章，等.桑叶多糖提取工艺优选［J］.中草药，2000，31(3)：347348.
        ［2］师勤，马国玉，徐珞珊，等.比色法测定蒺藜中多糖的含量［J］.中国药科大学学报，1997，28(5)：291293.
        ［3］周鹏，谢明勇，傅博强，等.茶叶粗多糖的提取及纯化研究［J］.食品科学，2001，22(11)：4648.
        ［4］崔秀明，董婷霞，陈中坚，等.三七多糖成分的含量测定及其变化［J］.中国药学杂志，2002，37(11)：818820.
        (江苏大学生物与环境工程学院制药工程系，江苏 镇江212013)