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       【关键词】  β
       摘要：目的探讨高效液相色谱（HPLC）法建立β细辛醚药代动力学的参数设置及生物样品制备条件筛选。方法在石菖薄挥发油β细辛醚在大鼠的药代动力学实例研究的基础上，对给药剂量、血样采集时间点、生物样品的贮存稳定性、蛋白沉淀剂的种类及剂量、样品提取和制备方法，以及流动相、波长、柱温等参数进行了比较。结果蛋白沉淀的种类及剂量、样品提取和制备方法对方法回收率及灵敏度影响较大；流动相、色谱柱、波长与流速等对分离度及保留时间影响较大。柱温以及样品温度影响较小。结论HPLC法建立β细辛醚药代动力学的方法学可靠、准确、回收率高。
       关键词：β细辛醚；   药代动力学；   方法学；   色谱条件
       Study on Methodology of βArarone Pharmacokinetics
       KE Xuehong
       (The Frist Affiliated Hospital，Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)
       Abstract:ObjectiveTo discuss the condition of HPLC and sample preparation of βAsarone pharmacokinetics.MethodsBase on pharmacokinetics research of βasarone in volatile oil of Acorus tatarinowii Schott in rat serum,to compare the condition of HPLC and sample preparation.ResultsThe main influence factors included mobile phase,chromatogram column,detection wavelength,way of sample preparation,kind and dose of proteinic precipitator.Temperature of column and sample were unconspicious.ConclusionMethod of HPLC βasarone pharmacokinetis is accurate and with high recovery.
       Key words:βAsarone;   Pharmacokinetics;   Methodology;   Chromatographic condition
   
　　利用体内药物分析技术，定量地测定血药浓度，求出系列动力学参数和药物制剂的生物利用度参数，对指导临床合理用药，确保临床用药的安全性和有效性等方面具有重要意义。一方面，随着色谱技术的迅速发展，尤其HPLC具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高、样品预处理简单等特点，使血药浓度分析更加准确，HPLC法在体内药物分析中的应用已大大超过其他分析方法，成为体内药物分析中应用最广泛的技术之一；另一方面，与常规药物分析相比，生物样品更为复杂，含有大量内源性干扰杂质，而且微量药物分布在大量生物介质中。因此，对微量药物从生物介质中提取、分离和分析，要求分析方法具有更高灵敏度和选择性。自2001年来，笔者在国内首次采用HPLC法建立了β细辛醚、α细辛醚的含量测定方法［1］，并对石菖蒲药材、石菖蒲挥发油及其复方制剂中两种成分进行分析［2~4］，在此基础上进一步深入开展了β细辛醚的药代动力学方法研究［5］。我们依据HPLC仪器及体内药物分析的特点，针对高效液相色谱条件及样品预处理条件展开了系统的方法学研究。
       　　1  器材
       1.1  仪器美国惠普公司HP1050-高效液相色谱仪；美国惠普公司6010型紫外-可见分光光度计；美国SIGMR公司 3K30型离心机；瑞士梅特勒公司AE-200型电子分析天平；Waters公司OASIS HLB固相萃取小柱（30 mg）。
       1.2  试药α-细辛醚对照品由中国药品生物制品检定所提供（采用面积归一化法测定，其含量为97.17%），β-细辛醚对照品由广州中医药大学第一附属医院实验中心提供（采用面积归一化法测定，其含量为99.32%），甲醇（一级色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司出品），十二烷基磺酸钠（分析纯，上海化学试剂公司出品），磷酸二氢钾（分析纯，广州化学试剂厂），石菖蒲挥发油（自制）。
       1.3  动物SD大鼠体重280~300 g，广东省医学实验中心动物提供，合格证为2001A046。
       　　2  方法与结果
       2.1  生物样品的采集
       2.1.1  给药途径有静脉给药和血管外给药（如口服、腹腔注射、皮下注射等）。采用口服给药，由于存在首过效应及吸收问题，数据波动大，可在口服给药前，动物禁食24 h，以免食物影响药物的吸收。
       2.1.2  给药剂量一般应是药效学实验的有效剂量。曾对3个剂量（大鼠灌胃，以β细辛醚计）0.02，0.04，0.06 g・kg-1进行比较，若取0.02 g・kg-1，4 h后血药浓度较低，分析测定困难而受到限制；0.04，0.06 g・kg-1在10 h前血药浓度均可检出，考虑到剂量太大时药物达到饱和，影响其动力学过程，笔者选用以0.04 g・kg-1为宜。
       2.1.3  血样采集时间点为提高参数计算的准确性，取样点的设计应兼顾到吸收相、分布相和消除相，由于β细辛醚在大鼠体内吸收、分布较迅速，达峰时间在10~15 min，半衰期在1~1.5 h，在实验及大量样品分析基础上，整个采集时间可选择1，5，10，15，20，30，60，120，240，360，420 min，并根据预试的结果来决定。
       2.1.4  生物样品的贮存采样后血浆和血清需要及时分离，除立即分析外，都应在适当条件下保存，以防止药物发生变化。β细辛醚具有挥发性，为了充分了解生物样品中β细辛醚的稳定性，对其储存期间的变化进行研究，样品在-30℃条件下贮存，分别在不同时间检测（1，2，3，4，5 d），以β细辛醚峰面积计算，变异系数4.21%，提示样品在此条件下保存5 d β细辛醚稳定性较好。
       2.2  生物样品的制备
       2.2.1  蛋白沉淀剂最常用的能与水混溶的有机溶剂如乙醇、甲醇、丙酮和乙腈，一方面是使蛋白质沉淀，另一方面使与蛋白质呈结合型的药物游离而释放。但使用甲醇沉淀蛋白质这种方法，β细辛醚回收率仅为80%~85%，解决方法可加入适量1%磷酸，使β细辛醚从蛋白质结合物中游离而释放，经实验证明回收率达95.74%~102.57%［5］。
       2.2.2  沉淀剂量分别将沉淀剂量设为1，2，4，6倍，研究表明2~4倍的沉淀剂量比较理想。即1 ml样品（血浆、血清等）加入2~4 ml沉淀剂，过少不能完全沉淀样品中蛋白质，此外分析色谱柱的柱效也容易下降，而过多则降低检出的灵敏度。
       2.2.3  体内样品提取和制备在体内药物分析时，容易出现两个主要问题，即样品的沾污和待测物的损失，由于β细辛醚具有挥发性，采用避免高温处理方法，使用甲醇提取，既可提取β细辛醚又可沉淀蛋白；若药物含量较低样品，可选用固相萃取方法，笔者使用OASIS HLB（Waters公司）固相萃取小柱，此法不仅待测组分得到纯化，而且不经高温直接浓集，大大提高最小检测浓度，方法回收率在95%~105%范围。
       2.3  色谱条件
       2.3.1  流动相首先选用了甲醇水体系，结果样品中β细辛醚与其它杂质得到较好的分离。考虑到样品中可能同时存在α细辛醚，对β细辛醚、α细辛醚的分辨率（R）进行考察，流动相为甲醇水=6∶4加入一定量离子对（十二烷基磺酸钠）、无机盐（磷酸二氢钾）使β细辛醚、α细辛醚R值增加，得到较理想分离效果。通过二极管阵列检测器检测以及色谱数据工作站纯度理论判断，β细辛醚的纯度良好，为纯化合物。最终选定流动相为甲醇水=6∶4，1 000 ml中加入磷酸二氢钾1.4 g、十二烷基磺磺酸钠1.2 g。
       2.3.2  测定波长选择取β细辛醚适量，用甲醇溶解后，吸取适量用流动相稀释，在200~400 nm的波长范围内扫描，结果在253 nm和303 nm处有最大吸收，由于253 nm处吸收度远大于303 nm处的吸收度，故选择253为检测波长。由二极管阵列检测器（DAD）检测图谱可知，杂质在此波长处均不干扰测定；对β细辛醚主成分峰的纯度分析结果表明β细辛醚为单一峰。
       2.3.3  柱温考察柱温对分离的影响不大，分别将柱温设为30，35，40，45℃，结果表明柱温对分离效能影响不大，但升高柱温可使保留时间有一定的减少。
       2.4  方法考察药代动力学研究能否顺利进行，主要取决于分析方法的可行性，因此，所建立的分析方法必须进行评估。一般常用专属性、标准曲线和最低检测浓度、可测浓度范围、加样回收率、精密度及稳定性等指标进行考察。
       2.4.1  专属性将空白血清色谱图与血清样品色谱图进行比较，结果表明血清样品经处理后，其中内源性物质不干扰β细辛醚的测定。在此色谱技术条件下，理论塔板数按β细辛醚峰计算大于3 000。
       2.4.2  标准典线和最低检测浓度空白样品加入β细辛醚，组成5~8个浓度的标准系列，要求覆盖实际的样品浓度范围。计算其线性方程和相关系数（r），r要求不应低于0.99。实验结果β细辛醚浓度在0.056~4.536 μg・ml-1的范围内，r=0.999 6［5］，表明色谱响应线性关系良好，当信噪比S/N等于3时，最小检测浓度为0.01μg・ml-1。
       2.4.3  回收率分别选取标准曲线范围高限、中限、低限的3个浓度进行，每一浓度重复做5次，要求添加的药物量必须与实际测量相近，测定峰面积代入回归方程计算浓度与加入的实际浓度比较，得方法回收率。建议回收率在90%~110%之间。以上建议基于如下结果：0.756，1.512，3.024 μg・ml-1三个浓度低、中、高的方法回收率分别为（97.25±4.83）%，（95.74±6.20）%，（102.27±5.12）%。一方面，回收率数值越接近100%，准确程度越好；另一方面，对一种分析方法来说，更重要的是每次测得回收率要保持恒定。
       2.4.4  精密度配制0.756，1.512，3.024 μg・ml-1三个浓度的对照血清，按样品的制备和检测，1 d内重复测定5次计算日内精密度。1次/d，连续5 d测定计算日间精密度，建议RSD不应大于10%。以上建立基于如下结果：日内RSD分别为3.57%，6.34%和4.78%；日间RSD分别为5.27%，7.25%，5.16%［5］，提示精密度良好。
       2.4.5  稳定性配制3个浓度（0.756，1.512，3.024 μg・ml-1）的对照血清各4管，1管立即测定，另3管在-30℃条件下贮存至少8 h后取出，室温解冻，测定其中1管；如此冷冻、解冻连续3次，考察经多次冰融后样品稳定性，计算样品β细辛醚浓度的RSD值，结果RSD小于5%，提示样品经3次冻融后样品仍保持稳定。
       　　3  讨论
       先后实验考察乙醇、甲醇、丙酮和乙腈的提取和沉淀蛋白质的效果，结果表明乙醇、丙酮和乙腈提取率较低；乙醇沉淀蛋白质的效果不理想。而甲醇提取杂质干扰少，回收率高，故选用甲醇为提取溶剂。若采用固相萃取方法对体内样品进行提取和制备，使用OASIS HLB固相萃取小柱的萃取过程中应缓慢操作，保持相对稳定，以提高提取回收率及每次测得回收率的恒定。我们的研究表明在HPLC色谱条件中流动相、色谱柱、波长与流速等对分离度及保留时间影响较大。柱温以及样品温度影响较小。当色谱条件初步建立后，尚需进一步优化，以保证所建立的色谱图技术稳定、可靠。条件允许应探讨不同色谱柱主流商品Symmetry、Zorbax、Hypersil、Nucleosil（C18、C8）等对色谱图的影响。即使流动相条件一致，用不同填料的色谱柱重复测试，不仅分离效果大不相同，而且保留时间的迁移程度也比较明显。
       　　参考文献：
       ［1］  柯雪红,魏  刚,方永奇.HPLC法测定石菖莆药材中β细辛醚、α细辛醚的含量［J］.中成药,2002,24(10):91.
       ［2］  柯雪红,方永奇.RP-HPLC法测定石菖莆、水菖莆药材中β细辛醚、α细辛醚的含量［J］.中国中药杂志,2004,29(3):279.
       ［3］  柯雪红,魏  刚,方永奇,等.HPLC法测定醒脑滴鼻液中β细辛醚、α细辛醚的含量［J］.中药新药与临床药理,2002,13(6):389.
       ［4］  柯雪红,方永奇.HPLC法测定神昌丸中β细辛醚的含量［J］.中国实验方剂学杂志,2004,10(4):15.
       ［5］  柯雪红,陈  为,黄可儿,等.反相高效液相法测定石菖莆挥发油β细辛醚血药浓度［J］.中国新药杂志,2004,13(8):723.

　　基金项目：广东省中医药管理局科研资金资助项目（No.101071）
       (广州中医药大学第一附属医院，广东 广州  510405)