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       【关键词】  白背叶根；抗乙型肝炎病毒；,,,HepG2.2.15细胞
         　　摘要：目的观察白背叶根体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的活性。方法以HepG2.2.15细胞株为模型，用微粒酶免疫测定技术（MEIA）检测细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg含量，用PCR荧光定量技术检测细胞上培养上清液中HBV DNA的变化，以MTT比色法观察药物的细胞毒性。结果白背叶根对HepG 2.2.15细胞的TC50为48.25 mg/ml，对抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为13.26和43.08。对HBVDNA仅有微弱抑制作用。结论白背叶根在体外细胞培养中具有直接抗HBV活性。
       关键词：白背叶根；   抗乙型肝炎病毒；   HepG2.2.15细胞
       白背叶根为大戟科野桐属植物白揪的根，在我国分布较广，资源丰富。异名白膜根、野桐根，味微苦、涩、性平，有清热、利湿、固脱、消淤等功效。民间常用鲜根水煎服治疗急慢性肝炎。动物实验证实白背叶根具有较好的抗肝纤维化、抗肝炎和抗肝伤作用［1，2］，为进一步了解白背叶根对HBV复制的影响，我们用HepG2.2.15细胞株为模型，观察白背叶根体外抗HBV活性，并对其作用机理初步探讨。
       　1  材料与方法
       1.1  药物白背叶根煎煮，水浴蒸发浓缩为2 g/ml，以8层细纱布粗滤后，经1 500 r/min离心10 min，上清液再用定性过滤液纸粗滤，25℃下测pH值为5.09，调节pH值为7.09，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置于4℃存放备用。干扰素α1b（赛若金）由深圳科兴生物工程股份有限公司提供，10万IU/支（实验用药）。
       1.2  细胞培养Hep G 2.2.15细胞来自南方医科大学（原第一军医大学）全军病毒性肝炎重点实验室。将HepG 2.2.15细胞接种于DMEM混合培养液（含20%胎牛血清、0.03%L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素、380 μg/mlG418），置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。换液1次/3 d，6~10 d传代。每次换液留取上清，检测HBVDNA分泌情况，表达稳定后开始实验。
       1.3  药物对HepG 2.2.15细胞的毒性实验根据Sargent JM等［3］建立的MTT比色分析法，判定各孔中存活细胞增殖代谢情况及细胞毒性反应。将白背叶根提取液用DMEM混合培养液分别稀释成1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96 mg/ml和1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96 μg/ml等20个实验浓度，培养细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为10×104/ml的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔0.1 ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养，于48 h后换入不同浓度含药DMEM混合培养液，同时设无药物细胞对照组，每浓度4孔，每4天换新鲜含药培养液，共2次。第8天每孔加入MTT溶液（1 mg/ml）200 μl，继续在37℃下孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清，然后每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min，使结晶物充分溶解，置入酶联检测仪中以570 nm波长测定各孔光吸收值（OD值），重复3次，依照ReedMuench法［4］计算药物对HepG 2.2.15细胞的抑制百分率（%）=（细胞对照组平均A组-实验组平均A值）/细胞对照组平均A值×100%；细胞半数有毒浓度（TC50）=Antilg［lgB+(50-B)的抑制百分率/（A-B）的抑制百分率）×C］×100%，治疗指数（TI）=半数有毒浓度（TC50）/半数有效浓度（IC50）。TI＞2为有效低毒，1＜TI＞2为低效低毒，TI＜2为毒性作用。注：A=lg＞50%药物浓度，B=lg＜50%药物浓度，C=lg稀释倍数。
       1.4  药物应用培养细胞用胰岛蛋白酶化，配制成浓度为10×104/ml的细胞悬液接种于24孔培养孔，每孔1 ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养，根据药物毒性度验结果，于48 h后换入6种不同浓度（31.25，15.63，7.82，3.91，1.96，0.98 mg/ml）的细胞全培养液，阳性对照药物为干扰素α1b（赛若金100，200，400IU），同时设不含药物的细胞对照组。每4天换新鲜含药培养液，共2次，于第4，8天留取培养液作为检测标本-20℃保存，同批次试剂同一时间检测。
       1.5  上清液中HBsAg，HBeAg的检测采用微粒酶免疫（MEIA）测定技术（美国Abbott公司AXSYM全自动免疫分析系统及试剂盒）检测，结果以S/CO值表示。抑制率=（细胞对照组S/CO值-药物组S/CO值）/细胞对照组/S/CO值×100%。
       1.6  上清液中HBVDNA的提取及定量检测采用PCR荧光定量技术检测上清液中HBV DNA定量。每个浓度重复测定3次，取平均值。HBV DNA抑制百分率（%）=（细胞对照组平均A值-实验组平均A值）/细胞对照组平均A值×100%。
       1.7  统计学分析结果用±s表示，组间比较用方差分析，采用SPSS11.0完成。
       　　2  结果
       2.1  白背叶根的细胞毒性实验结果显示，不同浓度的白背叶根对HepG2 2.2.15细胞均有不同程度的毒性作用，随着药物浓度增高，毒性作用逐渐增强，图1显示药物作用8 d后对HepG 2.2.15细胞的生长抑制情况。白背叶对HepG2.2.15细胞的TC50为48.25 mg/ml。
       图1  白背叶根对2.2.15细胞的抑制作用（略）
       2.2  白背叶对HBsAg，HBeAg的抑制效果根据药物的细胞毒性实验结果初定确定了用药浓度范围。从表1可见，白背叶根对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg、HbeAg均有抑制作用，并且随着药物浓度增加，抑制率逐渐增高；随着药物作用时间的延长，抑制率也逐渐增高。在同一浓度下，都表现为对HBeAg的抑制率高于对HBsAg的抑制率。白背叶根浓度在31.25 mg/ml时作用4 d对HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到26.27%，58.63%（P＜0.01），作用8 d对HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到59.74%，78.29%（P＜0.01），其IC50分别为3.64，1.12 mg/ml，对抑制2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为13.26和43.08。
       表1  白背叶根对2.2.15细胞（10×104）分泌HBsAg的抑制效果（略）
       与细胞对照组比较，*P＜0.01；与赛若金（500 IU/ml），▲P＜0.01
       表2  白背叶根对2.2.15细胞（10×104）分泌HBeAg的抑制效果（略）
       与细胞对照组比较，**P＜0.05，*P＜0.01；与赛若金（500 IU/ml），▲P＜0.01
       2.3  白背叶根对HBV DNA的抑制效果如表3所示 ，白背叶根对HepG2.2.15细胞分泌的HBV DNA仅有轻微抑制作用，随着药物浓度增加，抑制率逐渐增高；随着药物作用时间的延长，抑制率也逐渐增高，但与细胞对照组比较，无统计学意义。赛若金250 IU/ml组及500 IU/ml组对HepG2.2.15细胞分泌的HBV DNA有明显抑制作用，并且随着药物作用时间的延长，抑制率逐渐增高（作用4 d时P＜0.05，作用8 d时P＜0.01）。
       表3  白背叶根对2.2.15细胞（10×104）分泌HBVDNA的抑制效果（略）
       与细胞对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
       　　3  讨论
       HepG2.2.15细胞株是共转染法将克隆的HBV DNA及抗G418质粒转染人肝癌细胞株HepG细胞所建立的，能转录、翻译HBV基因，并能长期稳定地向培养上清液中分泌HBsAg，HBeAg和完整的Dane颗粒［5］，是目前国内外公认和常用的体外评价HBV药物的细胞模型。对HepG2.2.15细胞培养中HBV DNA及其抗原的动态分析表明［6］：细胞外HBV DNA水平与病毒抗原具有显著相关性，而细胞内HBVDNA水平与病毒抗原的相关性无统计学意义。为此，我们选择HepG2.2.15细胞分泌至培养上清液中HBV DNA及其抗原的变化作为观察指标，以判断白背叶根的抗HBV疗效。以往应用Hep G2.2.15筛选抗HBV药物的实验多采用Southren杂交、斑点杂交等方法测定HBV DNA，采用ELISA方法测定HBsAg和HBeAg，但这些方法存在敏感性低、重复性较差等缺点，影响了结果的可信性。本实验采用PCR方法荧光定量检测HBV DNA，采用微粒酶免疫测定技术半定量检测HBsAg和HBeAg，明显提高了实验结果的可信度。本实验结果表明：白背叶根在48.25 mg/ml浓度以下，对Hep G2.2.15细胞毒性较低；在浓度为31.25，15.63，7.82，3.91，1.96、0.98 mg/ml时对Hep G2.2.15细胞分泌的HBV DNA仅有微弱抑制作用，而对分泌的HBsAg、HBeAg均有明显抑制作用，并随时间和浓度增强，TI远大于是2，表明背叶根属有效低毒药物，是具有潜在的抗HBV开发前景的药物。应用Hep G2.2.15细胞模型进行的药理学实验只能反映药物对Hep G2.2.15细胞HBV标志物的抑制作用，不能反应体内免疫系统的调节，若再结合体内抗HBV实验，将更有助于白背叶根抗HBV的药效评价。
       　　参考文献：
       ［1］  赵进军,吕志平,王晓东,等.白背叶根在肝纤维化动物模型中抗氧化作用的实验研究［J］.中药材,2002,25(3):187.
       ［2］  赵进军,吕志平,张绪富.白背叶根对过氧化氢所致大鼠肝细胞损伤的保护作用［J］.华西药学杂志,2003,18(4):257.
       ［3］  Sargent JM,Taylor CG.Appeaisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukemia［J］.Br J Cancer,1989,60(2):206.
       ［4］  张吕克.中和实验技术［A］.黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术［M］.北京:科学出版社,1990,143.
       ［5］  Sells MA,Chen ML,Acs G.Production of hepatitis B virus particles on HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA.1987,(84):1005.
       ［6］  Liu MC,Yu M,Zhang NL.Dynamic analysis of hepatitis B virus DNA and its antigens in 2.2.15 cells［J］.J Viral Hepat.2004,11(2):124.
       (南方医科大学中医药学院，广东 广州  510515)