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       【关键词】  地榆；,,乌索酸；,,齐墩果酸；,,高效液相色谱
       摘要：目的建立地榆药材中乌索酸和齐墩果酸含量的测定方法。方法用高效液相色谱法。色谱柱为NovaPak C18 (3.9 mm×300 mm,4 μm),流动相甲醇水（88∶12)，检测波长210 nm。流速0.8 ml/min，柱温25℃ 。结果乌索酸进样量在0.106 2~1.593 μg，齐墩果酸进样量在0.040 6~0.609 μg时呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为99.73%和97.59%，RSD分别为1.5%和1.7%。结论方法灵敏、快速、准确，可用于地榆中乌索酸和齐墩果酸含量的测定。
       关键词：地榆；  乌索酸；  齐墩果酸；  高效液相色谱
       Determination of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Sanguisorba officinalis L. by HPLC
       ZOU Shengqin，CHEN Wu
       （Bioengineering Research Institute of Yichun University，Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines，Yichun，336000，China）
       Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC method for determination of ursolic acid and oleanolic acid in sanguisorba officinalis L.MethodsUrsolic acid and oleanolic acid was separated and analyzed on Nova-Pak C18 column (3.9 mm×300 mm, 4 μm)  with methanol-water (88:12) as mobile phase at flow rate of 0.8 ml/min. UV detection was at 210 nm and the column temperature was 25℃. ResultsAn average recovery of 99.73% was obtained with a RSD of 1.5% in the range of 0.106 2~1.593μg for ursolic acid. An average recovery of 97.59% was obtained with a RSD of 1.7% in the range of 0.040 6~0.609 μg for oleanolic acid.Conclusion The method was proved to be stable, fast, accurate and can be used for determination of ursolic acid and oleanolic acid in sanguisorba officinalis L..
       Key words：Sanguisorba officinalis L.；  Ursolic acid；  Oleanolic acid；  HPLC
   
　　地榆Sanguisorba officinalis L.是蔷薇科植物地榆的干燥根，在我国主要分布于江苏、湖南、安徽、甘肃、陕西等省［1］。地榆具有多种药用价值，能够凉血、止血、抗菌、解毒、止吐等，地榆炭粉对烫伤具有良好的治疗效果［2］。研究表明，地榆根中含鞣质约7%、三萜皂苷2.4 %~4.0 %，已分离出地榆皂苷Ⅰ，Ⅱ(其苷元为19α羟基乌苏酸)和地榆皂苷B及E(其苷元为乌苏酸)［3，4］。本研究采用高效液相色谱法测定了地榆中乌索酸和齐墩果酸的含量，证实地榆中有游离态的乌索酸和齐墩果酸存在，为评价药材的内在质量提供了依据。
       　　1  仪器与试药
       1.1  仪器高效液相色谱仪，515型泵，2996光电二极管矩阵检测器(PAD)，柱温箱，Empower中文色谱工作站（美国）；CP225D分析天平（德国Sartorius公司）； UPWSI10T高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）。
       1.2  试药 甲醇，色谱纯（上海陆忠试剂厂）；乙醇为分析纯（江西同盟试剂厂）；水为高纯水；乌索酸、齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110742200314，110709200304，供含量测定用)。地榆药材(市售)，经本所天然药物实验室鉴定为地榆Sanguisorba officinalis L.的根。
       　　2  方法与结果
       2.1  乌索酸和齐墩果酸检测波长的确定采用PAD检测器在190~500 nm波长范围内扫描，乌索酸和齐墩果酸对照品在流动相中的最大吸收波长均为202.2 nm（图1），但在低波长处，流动相有较强的末端吸收，经提取不同波长色谱比对，选取210 nm为检测波长，可在有效消除背景干扰时保证基线平稳和检测的灵敏度［5］。
       图1  乌索酸和齐墩果酸对照品的紫外光谱图 (略)
       2.2  色谱条件色谱柱：NovaPak C18 (3.9 mm×300 mm，4 μm，带保护柱)；流动相：甲醇水（88∶12）；检测波长：210 nm；流速：0.8 ml/min；柱温：25℃；外标法定量分析，乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于10 000。对照品和地榆样品的HPLC色谱见图2。
       a对照品  b地榆样品  1齐墩果酸  2乌索酸
       图2  对照品和地榆样品的HPLC色谱(略)
       2.3  标准对照品溶液配制 精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品10.62 mg，齐墩果酸对照品4.06 mg置10 ml容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，甲醇定容，作为乌索酸和齐墩果酸对照品混合储备溶液。精密吸取混合储备溶液1 ml至10 ml容量瓶中，加甲醇稀释，定容，制成含乌索酸0.106 2 μg/μl和齐墩果酸0.040 6 μg/μl的混合对照品溶液。
       2.4  地榆样品溶液的配制精密称取约5 g烘干的地榆（粉碎过20目筛），分别加入8倍量乙醇超声提取120 min，过滤，滤渣用乙醇洗涤，合并滤液定容至50 ml容量瓶中。滤液用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液作为样品溶液。
       2.5  线性关系的考察精密吸取对照品混合液1，4，7，10，15 μl分别进样分析，平行3次，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积平均值（μV・s）为纵坐标，以进样量(μg)为横坐标进行线性回归，乌索酸回归方程为Y=3.12×105X-1.35×104，r=0.999 8；齐墩果酸回归方程为Y=2.58×105X-1.03×104，r=0.999 5，表明当乌索酸进样量在0.106 2~1.593 μg，齐墩果酸进样量在0.040 6 ~0.609 μg之间时，呈良好线性关系。
       2.6  精密度实验 精密吸取乌索酸和齐墩果酸的对照品混合液15μl，重复进样5次，乌索酸峰面积相对标准偏差（RSD）为0.2 %，齐墩果酸的峰面积为0.6 %。表明进样方法和仪器精密度良好。
       2.7  重现性实验 精密称取同一批地榆样品5份，按2.4条件制备样品溶液，精密吸取15 μl进样分析，乌索酸峰面积的RSD为1.2%（n=5），齐墩果酸峰面积的RSD为0.9 %(n=5)，方法重现性良好。
       2.8  加样回收率实验 精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量的地榆样品，分别加入乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液适量（分高、中、低3组，每组平行2份），制备地榆加标样品溶液。进样测定乌索酸和齐墩果酸的含量，计算回收率。乌索酸和齐墩果酸的平均加样回收率分别为99.73 % （RSD=1.5 %）和97.59 %（ RSD=1.7 %）。
       2.9  样品含量的测定取不同批次地榆样品超声醇提溶液在上述色谱条件下进样，测定峰面积，平行3次，按外标法计算乌索酸和齐墩果酸平均含量，结果见表1。
       表1  地榆中乌索酸和齐墩果酸的含量(略)
       　　3  讨论
       3.1  地榆样品中2组分的紫外光谱与对照品归一化后完全重合，最大吸收波长均为202.2 nm，通过加标试验，组分峰面积相应增大，保留时间一致，从而可证实地榆中存在游离态的乌索酸和齐墩果酸。
       3.2  PAD检测器扫描分离组分的紫外吸收光谱快速、简便，在分离过程中即可确定被检测组分在色谱流动相中的最大吸收波长。且能同时提取不同波长下的色谱图进行对比，选择基线平稳，信噪比高的色谱进行定量计算，最大限度地保证分析结果的准确。
       3.3  流动相配比和色谱柱柱温对乌索酸和齐墩果酸的分离影响较大，经系统适应性考察，选择流动相为甲醇水(88∶12)，柱温25 ℃时能较好地将乌索酸和齐墩果酸分离，保留时间适当。方法简单易行，定量准确，回收率高，可同时测定地榆药材中乌索酸和齐墩果酸含量。
       　　参考文献：
       ［1］  中药大辞海编写组.中药大辞海［M］.北京：中国医药科学出版社，1993：1962.
       ［2］  江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科技出版社，1986：806.
       ［3］  曹爱民，张东方，沙  明，等.地榆中皂苷类化合物分离、鉴定及其含量测定［J］.中草药，2003，34(5):397.
       ［4］  原春兰，李宗孝，杨佩云.地榆中熊果酸的提取［J］.中国医药工业杂志，2002，33(10):478.
       ［5］  邹盛勤，陈  武.枇杷叶及其药渣中醇提成分含量的比较［J］.中国药房，2005，16(24):1916.

　　基金项目：国家“863”计划重点资助项目（No.2002AA2Z3217）
       （宜春学院生物工程研究所・江西省天然药物活性成分研究重点实验室，江西  宜春  336000）