文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【关键词】  肺纤维化；,,肾阳虚；,,糖皮质激素；,,受体
       摘要：目的探讨糖皮质激素受体(GR) mRNA在肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织的表达及其意义。方法60只健康SD大鼠，随机分为生理盐水组(NS)、肺纤维化组(BLM)及肾阳虚肺纤维化组(RYA)，每组再分成两亚组，每亚组10只,用博莱霉素气管内滴入及腺嘌呤灌胃复制肺纤维化及肾阳虚肺纤维化大鼠模型，于14 d及28 d取大鼠肺组织,运用组织芯片，通过HE及胶原纤维染色以判断肺炎症及纤维化程度和对肺内胶原蛋白定量，通过原位杂交(ISH)对肺组织GRmRNA表达进行定位定量分析。结果14 d时，肾阳虚组及肺纤维化组GRmRNA表达皆呈上调趋势,但无统计学意义(P>0.05)；28 d时，BLM组GRmRNA表达明显上调，与BLM组比较，RYA组GRmRNA表达则明显下调(P<0.05)。结论肺组织GRmRNA表达的上调是糖皮质激素防治肺纤维化之所以有效的机理之一，而肾阳虚状态下肺纤维化肺组织GRmRNA表达下调是临床上许多肺纤维化病人对糖皮质激素不敏感的原因之一，同时，温阳药也极可能具有防治肺纤维化的作用。
       关键词：肺纤维化；  肾阳虚；  糖皮质激素；  受体
       GR mRNA Expression in Lung Tissues in Pulmonary Fibrosis with Renalyang Asthenia and Pulmonary Fibrosis Rat Models
       YANG Liteng， CHENG Deyun ， FANG Xun， MU  Mao， NIE Li， HU  Xiaobo
       （Department of Respiratory Medicine,West-China Hospital,Sichuan University ,Chengdu 610041,  China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the glucocorticoid receptor(GR)mRNA expression in lung tissues in pulmonary fibrosis with renalyang asthenia and pulmonary fibrosis rat models and its clinical value.Methods60 healthy SpragueDawley rats were randomly divided into the NS group(NS),the pulmonary-fibrosis group(BLM) and the pulmonary fibrosis with renal-yang asthenia  group(RYA),every group had 20 rats and were subdivided into two subgroups by 14 days and 28 days courses,each subgroup had 10 rats.Pulmonary fibrosis rat models were established by blemycin-induced by way of oncedripping into trachea, in addition,  pulmonary fibrosis with renalyang asthenia rat models as well as adding adenine by primed-stomach once each day,on day 14 and day 28 respectively,these rats were killed and the rat lung tissues were acquired;and by means of tissue microarray associated with computer-picture analysis technology,the severe degree of inflammation and fibrosis,collagen quantity in rat lungs,were estimated by HE and collagen dye, GR mRNA expression were detected by in situ hybridization way.ResultsGR mRNA expression in rat lung of BLM were upregulated(P0.05),however,those in RYA were downregulated(versus BLM P0.05) on day28; GR mRNA expression among three groups were not significant on day14.ConclusionGR mRNA upregulation in lung tissue could be one of the mechanism of glucocorticoid"s effective cure for pulmonary fibrosis,and GR mRNA downregulation in lung tissue in renalyang asthenia syndrome could be one of cause of glucocorticoid"s noneffective therapy for pulmonary fibrosis,in addition,the Chinese traditional medicine with warming Yang effect could be effective therapy for pulmonary fibrosis.
       Key words：Pulmonary fibrosis;  Renal-Yang asthenia;   Glucocorticoid ;  Receptor
   
　　肺纤维化的治疗目前临床上仍以糖皮质激素为主，虽有一定疗效，但病情的进展恶化往往难以逆转甚至延缓；肾阳虚证经研究证实主要为下丘脑-垂体-靶腺轴(肾上腺、性腺、甲状腺)功能减退所致，肾上腺轴功能减退致糖皮质激素分泌减少为其主要机制之一［1］；此外，糖皮质激素只有与其受体(GR)结合方能将信号传递而发挥作用，故明确GR mRNA在肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织的表达，对评价糖皮质激素及具温肾壮阳(温阳)作用的中药在肺纤维化防治中的作用和指导其临床应用将具有非常重要意义。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料COOLPIX450高级数码像机(日本Nikon公司),美国Imagepro plus 专业图像分析软件系统(美国Media Cybernetics公司) ;Model 2000，MicroHybridization Incubator杂交箱(美国Robbins Scientific Corporation) ;GR原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司); 博来霉素(批号Y32480)15 mg/支(日本化药株式会社) ;腺嘌呤(Adenine  11003) (北京欣经科生物技术有限公司);健康SD大鼠60只,150~250 g,6~7周龄,雌雄各半(四川大学华西实验动物中心提供)。
       1.2  方法
       1.2.1  实验动物分组、动物模型的建立［2~4］及标本的采集①健康SD大鼠60只，雌雄各半，实验条件下饲养1周后分组，先按性别分层后随机分为生理盐水组(NS)、肺纤维化组(BLM)及 肾阳虚肺纤维化组(RYA)，每组20只，再据14，28 d两时相再分成两亚组，每亚组雌雄各5只；②大鼠称重后，予速眠新II(1 ml/kg)大腿外侧肌注麻醉，生效后在无菌操作下于颈前正中切开皮肤2~3 cm，钝性分离皮下组织及肌肉，暴露气管，用7号针头连1 ml注射器，于气管环间刺入气管后平行进气管，将针头斜面对着气管前壁缓慢滴入博来霉素(5 mg/kg)，然后缝合切口，将大鼠直立旋转使药液于肺内分布均匀，放回笼中正常饲养，并从即日起，BLM组每天灌胃生理盐水3 ml，RYA组，则在BLM组基础上每天灌胃腺嘌呤(300 mg/kg)；③ NS组气管内滴入生理盐水0.2~0.3 ml，并每天灌胃生理盐水3 ml。所有大鼠分别于第15天和第29天早上8~9点速眠新II麻醉下取标本。先于腹腔静脉抽血3~5 ml，静置15 min后3 500 r/min离心10 min，吸取上层血浆于Ep管中，于20℃保存备用，同时于腹主动脉放血至动物死亡后剖开胸腔将肺完整取出，先观察肺大体情况并称肺重，然后用4%多聚甲醛灌注左肺后剪下左肺下叶于4%多聚甲醛中固定；④按肺系数= 肺重 (g)/体重( g)×100%计算肺系数，肺纤维化程度越重，其肺系数就越大；⑤据文献方法［2~4］，从肺组织HE染色的病理改变胶原纤维染色及定量对肺纤维化模型进行鉴定，并在此基础上，结合大鼠的整体表现、肾脏的肉眼及显微镜下改变和肾功能及血浆皮质醇的变化对肾阳虚肺纤维化模型进行鉴定。
       1.2.2  效应指标的检测
       1.2.2.1  血浆尿素氮(BUN)肌酐(Cr)及皮质醇(Cor)含量测定①BUN和 Cr的测定采用比色法，严格按试剂盒说明书操作；② Cor的测定采用放射免疫法，并运用自动γ计数仪进行测定，严格按试剂盒说明书操作。
       1.2.2.2  组织芯片的制作及相关指标的检测［5，6］(1)制作:肺组织于4%多聚甲醛中固定8 h后制成蜡块，并将28 d BLM组作两份切片(6 μm)，用于从原位杂交(ISH) 水平鉴定组织芯片用。之后按文献方法［5,6］操作，将所有蜡块用于制作组织芯片，共制作4套组织芯片蜡块，同时相的3组标本放在同一组织芯片块上，每套两个组织芯片蜡块，每个蜡块含30点阵,每点直径2 mm。 切片:将组织芯片蜡块于切片机上切片(6 μm)，漂片后粘贴于玻片上于80℃烘烤3 h后室温下保存备用。将备用的组织芯片玻片分别用于HE及胶原纤维染色、原位杂交检测GR mRNA。鉴定:肉眼及用胶原纤维染色，观察玻片上各点阵情况，若点阵上各点完整无缺失则组织芯片合格。此外，从原位杂交GR mRNA定量比较组织芯片及原蜡块以鉴定组织芯片对原蜡块的代表性。(2)胶原纤维染色:采用显示胶原纤维细胞和肌肉的新染法，按文献方法［3］进行，结果判断为胶原纤维呈红色，细胞核和血细胞呈绿色，肌肉呈黄色。（3）GR mRNA.表达的原位检测［2,3］：①运用组织芯片，常规脱蜡脱水，在探针杂交前所用的液体皆加入RNA酶的抑制剂Erasol使浓度达0.1%；② 30%H2O21份加蒸馏水10份滴加于切片上室温10 min，蒸馏水洗3次；③ 切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，室温消化组织芯片5 min(石蜡切片10 min)，用原位杂交用PBS洗3次各5 min，蒸馏水洗1次；④室温后固定10 min，蒸馏水洗3次；⑤ 每张切片加20 μl预杂交液，放于湿盒中于杂交箱中40℃预杂交2 h，吸取多余液体后于每张切片加杂交液20 μl，盖上封口膜于杂交箱中40℃杂交过夜；⑥杂交后的洗涤:揭掉封口膜37℃左右水温的2×SSC洗5 min×2次；37℃0.5×SSC洗15 min×1次；37℃0.2×SSC洗15 min×1次；⑦滴加封闭液于37℃反应30 min，甩去多余液体后滴加生物素化鼠抗地高辛于37℃反应60 min，原位杂交用PBS洗5 min×4次；⑧滴加SABC于37℃反应20 min，原位杂交用PBS洗5 min×3次，之后滴加生物素化过氧化物酶于37℃反应20 min，原位杂交用PBS洗5 min×4次；⑨DAB显色20~30 min，水洗终止反应，经苏木素复染、盐酸酒精分化及自来水冲洗后脱水、透明、封片。⑷ 图像采集、处理及分析定量：利用 Imagepro plus 专业图像分析软件系统，于组织芯片上的每点(包括部份石蜡切片)的左右上下四个视野各采集一张100倍的图像用于图像处理及分析，4张图像的平均值代表该芯片上该指标的量，4套芯片上相对应的同一指标的4点再取平均值，代表该大鼠肺组织的该指标的量:①HE染色，运用图像分析软件的计数功能对图像上的细胞核进行分离然后自动计数细胞核数，每个细胞核代表一个细胞，并与正常对照组细胞数的均数比较，其高出的差值越大，示炎症程度越重；② 胶原纤维染色定量总胶原和原位杂交定量GR mRNA，运用图像分析软件先进行颜色分离，然后自动计算其积分光密度(IOD)；IOD为各个单独探测到的像素光密度的总和，包含了横向的面积和纵向的像素深度，其值越大示所检测指标含量越高，故IOD越大示纤维化程度越重，此外，由于图像分析软件不能区分肺组织的不同细胞，故只能肉眼定位，大致判断目的基因表达的分布。
       1.2.3  统计学处理实验数据用SPSS13.0软件行单因数方差分析(ANOVA),所测数据以 ±ｓ表示。
       　　2  结果
       2.1  动物表现肺纤维化组 (14 d及28 d)大鼠取食排便活动均减少，肾阳虚纤维化组还表现为消瘦，有的倦缩拱背，毛发松散脱落,口唇苍白,眯眼，尾巴湿冷。生理盐水组活动取食皆活跃。
       2.2  病理改变
       2.2.1  肾阳虚纤维化组双肾肿胀增大，表面见黄色米粒状颗粒弥漫分布，但不突起肺纤维化组和生理盐水组双肾无明显肿胀增大。生理盐水组肺表面光滑，呈粉红色，弹性良好；肺纤维化组及肾阳虚纤维化组肺呈暗红色，体积增大，弹性较差，表面凸凹不平，但肺纤维化组更为明显见。图1~3。
       1.NS(28d 肺肾)  2.BLM(28d 肺肾)  3.RYA(28d 肺肾)
       图1  各组大鼠肺肾大体改变比较（略）
       2.2.2  肾脏及肺病理光镜观察肾阳虚大鼠肾皮质区大多数肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜细胞增多，肾小球呈分叶状，除见较多异物肉芽肿结节之外，主要病变在肾小管，尤其是近曲小管与间质的炎症、异物肉芽肿、肾小管囊状扩张并有较多纤维化病灶形成。肺纤维化组和生理盐水组肾组织未见异常改变。生理盐水组肺组织结构清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡上皮细胞结构完整，胶原染色示无明显胶原沉积。肺纤维化组肺泡间隔显著增宽，肺泡腔变形、闭塞、成纤维细胞及其基质增生，其中有较多的单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润，胶原染色示红色的胶原条索状弥漫沉积，交织成网。肾阳虚纤维化组上述改变较轻，但炎性细胞浸润程度依旧；胶原染色示肺泡间隔区域胶原沉积减轻，但支气管壁及其周围仍沉积明显。见图2。
       2.3  各组肺系数肺炎症及纤维化程度比较14 d时，RYA组和BLM组肺胶原纤维的沉积及炎性细胞浸润皆非常明显，但二者比较无明显差异(P<0.05)，而肺系数RYA组大于BLM组(P<0.05)。28 d时，RYA组和BLM组肺系数、肺胶原纤维的沉积及炎性细胞浸润明显增加(P<0.05)，但RYA组肺系数增加更明显，胶原纤维的沉积却较BLM组轻(P<0.05)，炎性细胞浸润RYA组与BLM组无明显差异, 与14 d比较，BLM组胶原纤维的沉积明显加重(P<0.05)，炎性细胞浸润则加重不明显(P>0.05)，RYA组三指标则无明显差异(P>0.05) 。见表1。
       表1  各组肺系数肺炎症及纤维化程度比较（略）
       与NS组比较P>0.05;△, △△,△△△,,＃,＃＃, ＃,P<0.05;与BLM组比较＃,,P>0.05; , ＃,P<0.05;28 d与14 d比较, △△△, , ＃P>0.05; △△P<0.05
       1.NS(28d 胶原染色 ×100)        2.BLM(28d 胶原染色 ×100)        3.RYA(28d 胶原染色 ×100)图
       图2  各组大鼠肺组织胶原沉积程度比较（略）
       1.NS(28d ISH ×100)            2.BLM(28d ISH ×100)            3.RYA(28d ISH ×100)
       图3   各组大鼠肺组织GRmRNA表达比较（略）
       2.4  各组血浆Cr   BUN及Cor含量比较RYA组大鼠血浆Cr 及BUN皆明显升高，Cor则明显降低,提示RYA组大鼠肾阳虚形成；BLM组三指标则无明显改变。见表2。
       表2  各组血浆Cr   BUN及Cor含量比较（略）
       与NS组比较,*P>0.05, **P<0.05;与BLM组比较, **P<0.05;
       2.5  肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织GRmRNA的表达14 d时，RYA组及BLM组GRmRNA表达皆呈上调趋势，但与NS组比较无统计学意义；28 d时，BLM组肺组织GRmRNA表达明显上调，主要分布于Ⅱ型肺泡上皮及支气管上皮细胞、淋巴细胞及巨噬细胞的胞核胞浆中，而RYA组无明显上调，但与BLM组比较，GRmRNA表达则明显下调。见图3及表3。
       表3  肾阳虚肺纤维化和肺纤维化大鼠肺组织GRmRNA的表达（略）
       与NS比较*,＃, ＃＃P>0.05, ** P<0.05;与BLM组比较＃P>0.05, ＃＃P<0.05; *与**比较P<0.05
       3  讨论
       肺纤维化为肺间质结缔组织代谢失衡而过度沉积所致，目前还未有特效的治疗方法，临床上仍以糖皮质激素治疗为主，虽有一定疗效，但病情的进展恶化往往难以逆转甚至延缓；据研究证实，肾阳虚证的本质主要为下丘脑-垂体-靶腺轴功能减退所致，而温阳中药能改善此轴功能，其中，以肾上腺轴功能减退糖皮质激素分泌减少为主要机制［1］，据此机制，说明糖皮质激素具有温阳作用，而具有温阳作用的中药也可能具有防治肺纤维化的潜在价值；此外，糖皮质激素只有与其受体结合方能将信号沿受体后信号通路下传而调控靶基因的表达而发挥作用，故我们运用中西医结合之优势，建立了肾阳虚肺纤维化及肺纤维化大鼠模型，并从GR mRNA表达的水平来评估温阳中药及糖皮质激素在肺纤维化防治中的价值。据腺嘌呤致肾阳虚和博莱霉素致肺纤维化动物模型相关文献的评价方法［2~4］结合客观指标肾功能及血浆皮质醇的改变，说明肾阳虚肺纤维化及肺纤维化大鼠模型复制成功。据Pujol L［7］等研究发现，对糖皮质激素敏感的间质性肺疾病结节病和隐源性间质性肺炎患者肺组织GRalpha mRNA的表达明显高于对激素不敏感的特发性间质纤维化的患者，而GRbeta mRNA则无明显差异；但肺纤维化肺组织GR mRNA的具体表达情况目前还未完全明了。据我们的实验结果显示，在博莱霉素致大鼠肺纤维化形成过程中，GR mRNA在肺纤维化大鼠肺组织的表达于2周时无明显上调，4周时却明显上调,而此时相是以I型胶原纤维沉积为主，这就说明肺组织GR mRNA表达的上调是糖皮质激素防治肺纤维化之所以有效的机制之一；此外，大鼠肺组织的炎症反应程度于2周及4周两时相无明显差异，提示肺组织GR mRNA表达的上调与肺组织炎症反应程度无明显比例关系，说明糖皮质激素防治肺纤维化的作用并不完全依赖其抗炎作用。据实验结果显示，在大鼠肾阳虚肺纤维化形成过程中, 肺组织GR mRNA表达无明显上调，提示肾阳虚抑制了肺纤维化肺组织GR mRNA表达的上调，即在肾阳虚状态下肺纤维化肺组织GR mRNA表达下调；据中医认为，久病及肾，久病必累及肾之阴阳［8］，故随着肺纤维化病人病程的进展,常常会致肾阳虚之发生，而此时肺组织GR mRNA表达下调，这就是临床上许多肺纤维化病人对糖皮质激素不敏感及糖皮质激素未能阻止病程进展的原因之一，当然，肺组织GR mRNA表达下调也可认为是肾阳虚证的物质基础之一。此外，经上千年的临床实践已明确温阳药能纠正肾阳虚，现代研究也证实温阳药确能改善下丘脑-肾上腺轴之功能［1］，正常情况下，糖皮质激素高分泌日久会导致GR的下调，反之亦然，但在肾阳虚状态下，据实验结果显示血浆糖皮质激素及肺组织GR mRNA表达皆明显降低，故温阳药在改善下丘脑-肾上腺轴功能的同时也极有可能上调肺组织GR mRNA的表达, 而糖皮质激素防治肺纤维化的作用巳非常明确,故可认为温阳中药对肺纤维化具有防治作用,值得进一步研究。
       　　参考文献：
       ［1］  李  航，熊  境，周全荣.肾虚证现代研究进展［J］.中国中西医结合肾病杂志，2005，6(4): 246.
       ［2］  蔡后荣，裁令娟，郑培德.博莱霉素致大鼠肺纤维化胶原表达的研究［J］.江苏医药志，2001，27(3):184.
       ［3］  王伯坛，李玉松，黄高异，等.病理学技术［M］.北京：人民卫生出版社，2000：142,567,840.
       ［4］  吴启端，熊带水，梁文能.肾阳虚动物模型的研究概况［J］.中国实验方剂学杂志，2001，7(6):54.
       ［5］  Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrays for high-throughout molecular profiling of tumor specimens［J］. Nat Med, 1998,4:844.
       ［6］  Bubendorf L, Kononen J, Koivisto P, et al. Survey of gene amplification during prostate cancerprogression by high-throughput fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays［J］. Cancer Res 1999,59:803.
       ［7］  Pujols L, Xaubet A, Ramirez J, Mullol J,et al. Expression of glucocorticoid receptors alpha and beta in steroid sensitive and steroid insensitive interstitial lung diseases［J］.Thorax. 2004，59(8):687.
       ［8］  张庆荣.中医基础理论［M］.北京：中国中医药出版社，2004：271.
       (四川大学华西医院呼吸科，四川 成都  610041)