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       【关键词】  益气活血复方；,,,自发性高血压大鼠；,,,左室肥厚；,,,细胞凋亡
       摘要：目的探讨益气活血复方对自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats, SHR）左室肥厚(left ventricular hypertrophy, LVH)及左室心肌细胞凋亡的影响。方法雄性14周龄SHR 50只，随机分为复方高剂量组（SHRY1）、复方中剂量组（SHRY2）、复方低剂量组（SHRY3）、模型对照组（SHRC）、硝苯地平组（SHRX）。监测尾动脉收缩压（systolic blood pressure, SBP），每4周1次，8周后取材。测算心脏重量指数（heart weight index, HWI）、左室质量指数（left ventricular mass index, LVMI）；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）法结合图像分析、透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)技术检测左室心肌细胞凋亡。结果（1）与SHRC组比较，灌胃4周、8周后，各治疗组SBP显著降低（P＜0.01）；（2）与SHRC组比较，灌胃8周后，SHRY1、SHRY2及SHRX组HWI、LVMI、心肌细胞凋亡指数（cardiac myocyte apoptosis index, CMAI）均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；（3） TEM观察发现：SHR-C组可见部分心肌细胞核核膜皱缩，核染色质凝聚、趋边，偶见核固缩，部分心肌细胞线粒体明显肿胀。与SHRC组比较，SHRY1组上述病变明显减轻；SHRY2、SHRX组病变有所改善；SHRY3组病变改善不明显。结论 益气活血复方、硝苯地平均可降低SBP、抑制左室心肌细胞凋亡而防治、逆转LVH。
       关键词：益气活血复方；   自发性高血压大鼠；   左室肥厚；   细胞凋亡
       Effects of Yiqihuoxue Decoction on Left Ventricular Hypertrophy and the Cardiac Myocyte Apoptosis in Left Ventricle of Spontaneously Hypertensive Rats
       ZHANG Chun,     CHEN  Liguo,     DAI Yong,     HU Xiaoqin,    ZHENG Peie
       (First Affiliated Hospital, Jinan University，Guangzhou,Guangdong 510632,China;Medical College, Jinan University,Guangzhou 510632,China； Nanhai Hospital of Traditional Chinese Medicine,Foshan 528200,China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the effects of Yiqihuoxue decoction on left ventricular hypertrophy and the cardiac myocyte apoptosis in left ventricle of spontaneously hypertensive rats. MethodsFifty fourteenweekold male SHRs were divided randomly into 5 groups: SHRY1(treated with high dose of Yiqihuoxue decoction), SHRY2(treated with moderate dose of Yiqihuoxue decoction), SHRY3(treated with low dose of Yiqihuoxue decoction), SHRC(untreated), and HRX(treated with Nifedipine). The systolic blood pressure(SBP) was measured before treatment and during treatment every four weeks. After 8 weeks treatment, all rats were killed. Heart weight index(HWI), left ventricular mass index(LVMI) were calculated. Combined with automatic imaging analysis technology and transmission electron microscope(TEM), cardiac myocytes" apoptosis in left ventricle was detected by using in situ terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) staining. Results(1) After 4 or 8 weeks" treatment,  compared each treatment group with SHRC, the SBP  decreased significantly(P＜0.01).  (2) After 8 weeks" treatment, compared SHRY1, SHRY2 and SHRX with SHRC respectively, HWI, LVMI and CMAI decreased significantly(P＜0.05 or P＜0.01).  (3) The results under TEM were: In some left ventricular tissues obtained from SHRC group, nuclear membrane shrank and nuclear chromatin condensed and congregated under nuclear membrane like speckle, abutting against the nuclear envelope; We observed pyknosis by chance. Mitochondria of some myocardial cells were markedly swollen with some disorganized or disrupted mitochondrial cristae which displayed like uneven vacuole. Compared with SHRC, the above-mentioned pathological changes of SHRY1 were less obvious; the pathological changes ameliorated slightly in SHRY2 and SHRX; but there was no significant improvement in SHRY3.  ConclusionYiqihuoxue decoction and Nifedipine could prevent and reverse LVH by means of reducing the SBP and inhibiting the cardiac myocytes" apoptosis in left ventricle.
       Key words： Yiqihuoxue decoction;   Spontaneously hypertensive rats;   Left ventricular hypertrophy;  Apoptosis
   
　　左室肥厚（LVH）是心肌细胞肥大所致的心脏扩大及左室重量增加，多见于高血压病的中晚期，可能是心脏对高血压的持续性负荷发生的一种慢性适应性过程，其发生机制目前尚未完全阐明。近年研究表明：高血压病的主要靶器官（心、脑、肾）中均存在细胞凋亡现象［1~4］，抗高血压药物如血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂（CCB）等则能影响机体靶器官的细胞凋亡［5，6］。由此推测细胞凋亡在高血压LVH及心力衰竭中起不可忽视的重要作用。中医学认为，高血压LVH的可能机理在于久病气虚血液，本虚标实［7，8］。据此，我们确立益气活血作为防治LVH的主要治法，自拟益气活血复方。既往的实验研究［9］已证实：益气活血复方具有CCB样作用。本研究旨在探讨不同剂量益气活血复方对自发性高血压大鼠LVH及左室心肌细胞凋亡的影响。
       　　1  材料与方法
       1.1   药物益气活血复方由人参、黄芪、当归、川芎、赤芍、丹参、葛根、降香等组成（广州二天堂医药公司提供），加水煎成200 ％浓度（即1 ml药液含2 g生药）。硝苯地平，10 mg/片（广东华南制药厂 批号：040602）；原位细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒（德国Roche Molecular Biochemicals公司 批号：11684817910）；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
       1.2  动物及分组 清洁级雄性14周龄SHR大鼠50只，体重(257±12) g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。普通饲料喂养，避免噪音及其他干扰，观察期为8周。SHR随机分为5组，即复方高剂量组（SHRY1）、复方中剂量组（SHRY2）、复方低剂量组（SHRY3）、模型对照组（SHRC）、硝苯地平组（SHRX），每组10只。按体表面积法［10］换算得出：大鼠复方每日用量为13 g/kg体重，硝苯地平每日用量为5.4 mg/kg体重。以复方换算剂量为SHRY2组给药剂量，SHRY1、SHRY3组分别为其3、1/3倍；SHRX组按大鼠换算剂量灌胃。即：SHRY1、SHRY2、SHRY3、SHRX组分别予以39 ，13 ，4.3 ，5.4 mg/kg・d药物灌胃；SHRC组予以等体积蒸馏水灌胃。动物禁食12 h后灌胃，1次/d。将药物按不同剂量以蒸馏水稀释，最终每只动物均给予5 ml液体灌胃。干预8周间，每周称重1次，根据体重调整药量。
       1.3  指标检测
       1.3.1   SBP测定  SHR 40 ℃预热10 min后，用RBP1 B型大鼠尾压心率测定仪（中日友好临床医学研究所研制）测量SHR清醒、安静状态时尾动脉SBP，连续测量3次，间隔约1 min/次，取其均值作为该SHR的SBP（kPa）。实验前测压1次，以后每4周测压1次。
       1.3.2  HWI、LVMI测定将禁食12 h的SHR用3 ％戊巴比妥钠行腹腔注射（30 mg/kg），麻醉后再次称重，开胸取心，冲洗血污，滤纸吸干水份后，称取心脏重量。沿房室交界处去除心房、大血管及右心室游离壁，将左室游离壁和室间隔准确称重，作为左心室重量。心脏重量、左心室重量与动物体重的比值分别作为HWI（mg/kg），LVMI（mg/kg）。
       1.3.3  心肌细胞凋亡检测与半定量分析 取左室游离壁水平轴中部心肌约1.5 cm × 0.8 cm × 0.4 cm，立即置于4 ％多聚甲醛液（pH 7.4、4 ℃）固定24 h以上，常规石蜡包埋，切片（4 μm），检测步骤简述如下：切片常规脱蜡至水，用3 %H2O2甲醇溶液猝灭10 min，以封闭内源性核酸酶，降低非特异性着色。PBS洗3次，用10 μg/ml蛋白酶K溶液滴片，室温孵育20 min。PBS洗3次，然后滴加TUNEL反应液（体积比：TDT酶∶标记缓冲液=1∶18），37 ℃孵育60 min。PBS洗3次，滴加converterPOD（用PBS按1∶1稀释），37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，用DAB显色试剂盒显色5 min，苏木素复染20 s，然后将切片常规脱水、透明、封片。根据左室组织结构中心肌细胞的形态特征及在长轴上心肌细胞核呈椭圆型等特征区分心肌细胞与非心肌细胞，以除外凋亡的非心肌细胞。光镜下，非凋亡细胞核染呈紫蓝色，凋亡细胞核染呈褐色。每个标本观察1张切片，每张切片随机计数6~8个高倍镜视野（high power field, HPF 400×）中凋亡心肌细胞核数目及其与视野中总心肌细胞核数目的百分比，求百分比的均值即为心肌细胞凋亡指数（cardiac myocyte apoptosis index, CMAI）。
       1.3.4  电镜标本制备每组随机取2只SHR，取其左室游离壁中部心肌约2 mm × 3 mm × 5 mm，立即置于2.5 %戊二醛固定液1 h，在垫有冰块的平皿上迅速切取约1 mm3 的组织块，置于新鲜的2.5 %戊二醛固定液4 h以上，低温保存。0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤3次后，加入1 %锇酸固定液，4 ℃下固定1.5 h。常规乙醇、丙酮逐级脱水，Epon 812树脂平板定向包埋。用Reichert Jung Ultracut E 超薄切片机先切约1.0 μm半薄切片，1 ％甲苯胺兰染色，光镜观察定位，再行超薄切片。超薄切片醋酸双氧铀硝酸铅双重染色，JEOL100CXⅡ/T透射电镜观察、摄片。
       1.4  统计学处理 所有计量资料均采用 ±s表示，对来自同一整体的数据进行正态性检验。组间比较，采用单因素方差分析；组内比较，采用t检验。取检验水准α=0.05，运用SPSS 11.5进行统计学分析。
       　2  结果
       2.1  各组SBP、HWI、LVMI、CMAI比较随着周龄增加，SHRC组SBP逐渐升高（P＜0.05或P＜0.01）。灌胃4周、8周后，与SHRC比较，各治疗组SBP均明显降低（P＜0.01）。灌胃4周后与治疗前比较，SHRY1，SHRY2，SHRX组SBP均降低（P＜0.05或P＜0.01）。灌胃8周后与治疗前比较，各治疗组SBP均明显降低（P＜0.01）。灌胃8周后，SHRY1，SHRY2，SHRX组HWI，LVMI，CMAI均较SHRC组降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1及图1~6。
       表1  各组SBP，HWI，LVMI比较(略)
       与SHRC比较，#P＜0.05，# #P＜0.01；与SHRY3比较，●P＜0.05；与灌胃前比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；n=8
       图1  SHRC组(×400)  (略)               
       图2  SHRY1组(×400) (略)                
       图3  SHRY2组(×400) (略)
       图4  SHRY3组(×400)  (略)               
       图5  SHRX组(×400)  (略)               
       图6  阴性对照片 (×400)(略)
       2.2  各组SHR左室心肌电镜检查结果 SHRC组可见凋亡心肌细胞。凋亡心肌细胞核核膜皱缩，染色质凝聚、趋边，在核膜下聚集呈斑块状；部分核仁消失，偶见胞核固缩。肌原纤维模糊、排列紊乱、部分溶解，以闰盘两侧为重。部分心肌细胞线粒体肿胀，线粒体嵴部分紊乱、断裂溶解，内有大小不等的空泡区形成。与SHRC组比较，SHRY1组上述病变程度明显减轻；SHRY2、SHRX组病变有所改善；SHRY3组病变改善不明显。（图7~12）。
       图7  SHRC组(×13 000) (略)                 
　　
　　图8  SHRC组(×10 000) (略)                
       图9  SHRY1组(×8 000) (略)  
       图10  SHRY2组(×13 000)(略)                 
       图11  SHRY3组（×10 000) (略)                 
       图12  SHRX组   (×8 000)(略)
       　　3  讨论
       从细胞生物学观点看，左室重塑主要由细胞凋亡、适应新的负荷与条件、左室纤维化［11］等因素决定。其中细胞凋亡是重要前提，其本身可导致修复性的纤维化；另一方面，心肌细胞凋亡导致有效收缩功能单位进行性丧失，存活心肌细胞的代偿性功能增强，但当超过一定限度，发生失代偿，即引起存活心肌细胞的适应性肥大、细胞外基质沉积与反应性间质纤维化。心肌细胞凋亡在SHR的LVH中起重要作用，存在明显的细胞凋亡“时间窗（time window）”。新生SHR在出生后几周内，高血压靶器官细胞以增生为主，心肌细胞凋亡明显不足；而后，在高血压的进展过程中，细胞凋亡开始增多，其机制尚不明确，可能与心肌细胞过度增生的代偿性反应（即代偿性心肌细胞凋亡）有关［4，12~14］。在SHR1月龄（无左室肥厚）→10月龄（明显左室肥厚）→18~20月龄（充血性心力衰竭）的进展过程中，存在心肌细胞凋亡的动态变化［15］。然而，在SHR的LVH形成、发展过程中，左室心肌细胞凋亡增加、减少的“时间窗”太过笼统，期间各时期心肌细胞凋亡增加、减少的具体情况尚不明确，缺乏相应的实验研究。因此，本研究选择尚处高血压早期［16，17］的雄性14周龄SHR为研究对象，运用TUNEL法结合图像分析、透射电镜技术，检测灌胃8周后各组SHR左室心肌细胞凋亡。结果显示：22周龄时，SHRC组CMAI较高。与SHRC组比较，SHRY1、SHRY2及SHRX组CMAI呈不同程度下降（P＜0.05或0.01）；SHRY3组CMAI降低不明显（P＞0.05）。SHRY1、SHRY3组比较，差异显著（P＜0.05）；SHRX组与SHRY1、SHRY2、SHRY3组比较，均无显著差异（P＞0.05）。透射电镜观察亦支持TUNEL检测结果。本课题之益气活血复方选用人参、黄芪、当归补气养血；丹参、川芎、赤芍活血行气止痛；降香行气止痛、活血止血。葛根扩张冠状血管，减少外周阻力而降血压。现代研究证实：人参皂苷为人参的主要有效成分之一，人参皂苷Rb1能阻滞细胞膜上钙离子通道的活动，减轻细胞内钙离子的积聚而抑制细胞凋亡［18］。黄芪具有双向免疫调节、扩张血管、抗缺氧等功能；当归中阿魏酸有很强的抗氧化与清除氧自由基，降血脂及改善动脉粥样硬化，抗菌、抗血栓等作用［19］；丹参能拮抗心肌细胞Ca2+内流，具有CCB样作用［20］；并有拮抗血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)促心肌细胞肥大的作用［21，22］；同时能明显上调参与抑制细胞凋亡的重要基因Bcl2基因蛋白表达，显著抑制SHR心肌细胞凋亡［23］。川芎、赤芍合用可明显降低血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白，在抗氧化及保护血管内皮细胞功能方面，有协同作用［24］。本研究结果提示：益气活血复方、硝苯地平均能降低SBP，HWI，LVMI，抑制LVH形成、发展过程中左室心肌细胞凋亡。两者抑制心肌细胞凋亡，防治、逆转LVH的可能机制为：① 扩张阻力血管，减轻心脏后负荷，心肌做功减少，LVH减轻；② AngⅡ通过刺激交感神经系统兴奋或组织局部AngⅡ直接促进心肌蛋白合成，使心肌细胞生长肥大而致LVH，AngⅡ的这些作用依赖于细胞内钙水平，需要钙离子介导。CCB通过减少胞内钙而阻断AngⅡ的作用，使LVH减轻；③ 上调参与抑制凋亡的Bcl2基因蛋白表达和（或）下调参与促进凋亡的Bax基因蛋白表达，抑制SHR心肌细胞凋亡。益气活血复方防治、逆转LVH的具体途径、机制有待进一步研究。
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　　基金项目：广东省中医药局立项资助课题（No.1050116）
       (暨南大学附属第一医院，广东 广州  510632；暨南大学医学院，广东 广州  510632；佛山市南海区中医院，广东 佛山  528200）