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       【关键词】  超声技术；,,正交实验；,,丹皮酚；,,总多糖；,,苯酚
       摘要：目的探讨超声技术对六味地黄丸复方提取效果的影响，并筛选出最佳提取工艺，确定超声提取中药复方的适应范围。方法以干膏收率、丹皮酚、总多糖为指标，对六味地黄丸复方进行超声提取正交实验，筛选出最佳提取工艺条件，并与传统提取方法回流进行比较研究。结果最佳提取工艺为A2B2C2D1E3F2，即用10倍量初始温度为60℃的60%乙醇超声提取2次，30 min/次，超声频率为25kHz。结论所筛选出的最佳提取工艺合理、可行；超声提取技术能适用于含有多糖类成分的中药复方药材，具有省时、省工、提取率高等特点。
       关键词：超声技术；  正交实验；  丹皮酚；  总多糖；  苯酚硫酸法
       Study on Extract Technology of Compound Liuweidihuang Pill with Supersonic Method
       XU Fei， YIN Rongli，ZHONG Ling，DU Sujuan，MA Jiahua
       (Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Chengdu 611730;China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of supersonic method on the process of extraction from compound Liuweidihuang Pill, to get the optimum exracting condition and to determine the limits of supersonic method.MethodsWith gangao-yield, paeono, polysaccharideas indexes ,supersonic -extraction was adopted to study with orthogonal design, then gain better extracting method.Take the way as using traditional refluxing-extraction method to compare.  ResultsThe optimum extraction condition is A2B2C2D1E3F2, adding ten times amount of 60% ethanol (original temperature 60℃)and supersonic  extracting(the frequency 25kHz) for 30min(totally extracting for 2 times). ConclusionThe result from supersonic extraction is so stable and reliable that orthogonal design can be adequate for polysaccharide compositions of traditional Chinese medicine and it has characteristics of saving on time and operator, higher extraction rates and so on.
       Key words：Supersonic technology ；  Orthogonal design ；  Paeonol ；  Polysaccharide ；  Phonel-sulfate method
   
　　超声技术提取中药具有提取效率高、省工、省时、节能等优点［1~6］， 但仅局限于单味中药的提取,而中医用药多以复方制剂为主,药物发挥的是多成分、多靶点的综合治疗作用,使超声技术受到了限制，中药复方采用超声提取技术目前还是个空白。本研究拟用中药复方六味地黄丸为模型药物进行比较研究，以确定超声提取中药复方的适应范围，并优选出最佳工艺条件。六味地黄丸为滋阴补肾的经典代表方剂，自创方以来经历代医家临床应用疗效显著，广泛运用于治疗肝肾阴虚、腰膝酸软、盗汗遗精等疾病［7］；现代药理研究表明，该方具有抗衰老、抗肿瘤及治疗老年痴呆的显著效果，对免疫功能也具有显著的调节作用［8］。丹皮酚具有免疫调节作用［9］，为六味地黄丸复方各种制剂控制其质量的指标成分之一，而总多糖是六味地黄丸复方治疗肝肾阴虚及老年痴呆、抗衰老、抗肿瘤的主要有效物质之一，故以干膏收率、丹皮酚、总多糖含量（权重系数2∶4∶4）为提取工艺的评价指标。
       　　1  仪器与试药
       PerkinElmer Lambda35 uv/vis 型分光光度计；Sartorius BP211D型电子天平（德国赛多利斯公司）；熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻药材（均购于成都市荷花池中药材市场）；苯酚试剂：取苯酚(CP)200 g，加铝片0.2 g和碳酸氢钠0.1 g，蒸馏收集182℃馏分，新蒸苯酚配成5%(m/v)的水溶液，摇匀备用；其余试剂均为分析纯。 
       　　2  方法与结果
       2.1  含量测定方法
       2.1.1  丹皮酚含量测定方法［10］供试品溶液的制备：精密称取样品适量，用水蒸气蒸馏，收集馏出液约450 ml，置500 ml量瓶中，加水稀释至刻度，备用。含量测定方法：以蒸馏水为空白对照，照紫外可见分光光度法，在274 nm波长处测定吸光度，按丹皮酚（C9H10O3）的吸收系数E1 cm 1%为862计算，即得。
       2.1.2  总多糖含量测定方法（苯酚硫酸法)［11］ 对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品30 mg置烧杯中，加适量蒸馏水溶解，然后定量转移至100 ml量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，备用。供试品溶液的制备：精密称取样品提取液适量 ，将其调至含醇量80%，静置3 h，滤过，残渣200 ml蒸馏水溶解，滤过，滤液用蒸馏水定容至250 ml量瓶中，摇匀备用。标准曲线的制备：精密吸取葡萄糖对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml至50 ml量瓶中，加蒸馏水至刻度。分别精密吸取上述溶液2.0 ml置于10 ml具塞试管中，分别加入5％苯酚1.0 ml，迅速滴加浓硫酸5.0 ml，振摇，至沸水浴中20 min后，转入冷水中冷却30 min，取出，即得；另以2.0 ml蒸馏水同上操作，作为空白对照；于490 nm处测定吸光度。以对照品浓度（μg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：A=0.291 4C+0.020 1 ，r=0.999 4。可见，葡萄糖对照品在6.104～30.52μg/ml范围内与吸光度具有良好的线性关系。测定方法：精密吸取供试品溶液2.0 ml，置于10 ml具塞试管中，照“标准曲线的制备”项下方法，自“加入苯酚1.0 ml”起，依法测定吸光度，代入回归方程，计算，即得。
       2.2  超声提取工艺最佳提取条件的考察
       2.2.1  提取溶剂的考察以10倍处方量初始温度为30℃的水、60%乙醇、95%乙醇为提取溶剂对六味地黄丸复方药材粗粉进行超声提取2次，45 min/次，超声频率25kHz；以干膏收率、丹皮酚、总多糖为指标，筛选出最佳提取溶剂。实验结果见表1。 结果表明，以60%乙醇为提取溶剂，其干膏收率、丹皮酚含量、总多糖含量均高于其他提取溶剂。故采用其为最佳提取溶剂。
       2.2.2  60%乙醇超声提取复方药材正交实验正交表头设计及实验结果见表2~4。由直观分析可知，影响60%乙醇超声六味地黄丸复方药材的因数顺序为E>D>B >C > A>F，经方差分析，超声初始温度对六味地黄丸复方药材的60%乙醇超声提取有显著性影响，药材粒度对其的影响较小，为了避免产生过细粉，节约成本，由此可得出该最佳工艺为A2B2C2D1E3F2，即用10倍量初始温度为60℃的60%乙醇对复方药材粗粉进行超声提取2次，30 min/次，超声频率为25kHz。
       表1   溶剂考察结果(略) 
       表2  正交实验因素水平(略) 
       表3  正交实验结果(略)    
       表4  方差分析(略) 
       F0.05(2,5)=5.786 1; F0.01(2,5)=13.274
       2.3  60%乙醇回流提取工艺最佳提取条件的考察正交表头设计及实验结果见表5~7。  
       表5  方差分析(略) 
       由直观分析可知，影响60%乙醇回流提取六味地黄丸复方药材的因数顺序为C> B > A；经方差分析，提取次数对六味地黄丸复方药材的60%乙醇回流提取有显著性影响。加60%乙醇量、回流时间两因数对其的影响较小，为了节约成本，由此可得出其最佳工艺为A1B2C3，即8倍量60%乙醇回流提取3次，1.5 h/次。
       2.4  结论以干膏收率、丹皮酚、总多糖为指标，对超声、回流提取六味地黄丸复方药材结果进行比较，见表8。  
       表6  正交实验结果(略) 
       表7  方差分析(略) 
       结果表明60%乙醇超声提取效果明显优于回流提取法，最终确定六味地黄丸的最佳提取工艺为用10倍量初始温度为60℃的60%乙醇对复方药材粗粉浸泡6 h后，超声提取2次，30 min/次，超声频率为25kHz。  
       表8  超声、回流提取六味地黄丸复方药材结果比较(略) 
       　　3  讨论 
       超声提取对多数单味中药材虽然有提取效率高、省工、省时、节能等优点，但对中药复方是否具有相同的效果？在本研究中超声提取效果明显优于回流提取法，具有省时、省工、提取率高等特点。但是本研究只是选择了含有多糖类成分的六味地黄丸复方为模型药物，要充分证明超声提取技术在中药复方中的优越性，确定其在中药复方中适应范围，及其是否适用于大生产，还有待进一步研究和讨论。
       　　参考文献：
       ［1］  胡松清，马尚昌，高胜东，等.功率超声在生物工程中的应用［J］.应用声学，2000，19（3）：87.
       ［2］  刘  莹.中国一定能争第一.重庆医科大学超声刀研制纪实［N］.科技日报，1999.4.
       ［3］  王保强，王敬东，尹蓉莉，等,超声效应在生物工程中应用的电声参数优化［J］.成都信息工程学院学报, 2002，21（4）：76.
       ［4］  郭孝武，林书玉，王蕊娥.不同频率超声对提取芸香苷成分的影响［J］.陕西师范大学学报(自然科学版)，1996，24(1):50.
       ［5］  郭孝武.超声技术在中草药成分提取中的应用［J］.中草药，1993，24(10):548.
       ［6］  郭孝武.超声与常潜贡对部分中药苷类成分提出率比较［J］.中国医药工业杂志，1998，29(2):51.
       ［7］  超长青，朱云龙. 六味地黄丸（汤）的药理研究进展［J］.中国医学报，1998，13（4）：636.
       ［8］  赖益忠，黄倬伟. 六味地黄丸（汤）现代研究新进展［J］.中医药信息，1999，4：13.
       ［9］  章灵华，肖培根，黄  艺，等.丹皮酚的药理与临床研究进展［J］.中国中西医结合杂志，1996，16（3）：188.
       ［10］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：137.
       ［11］  汪显阳，姚春艳，张佩文.六味地黄丸中多糖含量测定研究［J］.中医药研究，2000，16(4):42.

　　基金项目：四川省教育厅基金资助项目（No.2004A051）
       (成都中医药大学，四川 成都  611730)