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       【关键词】  虎杖；,,,白藜芦醇；,,,大孔树脂；,,,硅胶柱层析
       摘要：目的优选虎杖的白藜芦醇最佳提取工艺。方法①采用正交实验法，以白藜芦醇提取量为指标，高效液相色谱法（HPLC）测含量，优选提取工艺条件。②以大孔树脂富集及色谱法分离、纯化白藜芦醇。结果乙醇提取最佳工艺为10倍量的90%乙醇回流提取2次，1 h/次。经AB8树脂吸附富集，硅胶柱色谱纯化，可获得高纯度的白藜芦醇产品。结论该工艺可用于指导生产。
       关键词：虎杖；   白藜芦醇；   大孔树脂；   硅胶柱层析
       Study on Extraction Process of Resveratrol in Polygonum cuspidatum
       XU Hanlin, FU Yihe, GAO Peng, XU Chengjun
       (Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061;Yichang Institue for Drug Control,Yichang 443007,China)
       Abstract:ObjectiveTo study the optimum extraction process of resveratrol in Polygonum cuspidatum.Methods①The optimum extraction process was investigated by orthogonal design and the index of the method was the contents of resveratrol.②The technology of macroporous adsorptive resin and chromatography was used in the separation and purification of resveratrol by HPLC.ResultsThe optimum condition of ethanol extraction:10 times amount of 90% ethanol and extracted 2 times,1 hour one time.The purity of the product was gained by the technology of resin AB8 adsorption and silica column chromatography purification.ConclusionThe optimum extraction process can direct production.
       Key words:Polygonum cuspidatum;   Resveratrol;   Macroporous adsorptive resin;   Slica column chromatography
   
　　白藜芦醇（3，4′，5，三羟基二苯乙烯；transresveratrol）是一类亲脂性多酚物质，在虎杖、葡萄、花生、松树等植物中存在，其中以虎杖的含量为最丰富。其游离的白藜芦醇高于0.58%［1］。虎杖为蓼科植物虎杖Polyponum cuopicltum Sied.et Zucc的根茎。具有祛风利湿、散淤定痛、止咳化痰功效［2］。白藜芦醇具有抗血小板凝聚，保护肝脏，抗肿瘤活性等药理作用，特别是对心脑血管系统具有较强的药理活性。本实验采用正交实验，利用乙醇回流提取的方法和大孔树脂吸附及硅胶柱色谱技术，并采用HPLC方法进行含量测定［3，4］，对虎杖中的白藜芦醇进行提取分离纯化研究。本研究旨在为虎杖开发利用提供科学依据。
       　　1  材料与仪器
       DIONEX HPLC色谱仪P680 HPLC Pump.UVC 170检测器Chromeleon工作站万分之一电子天平BS110S（Sartorius公司）白藜芦醇对照品（Sigma公司）虎杖饮片（湖北省药材公司）经鉴定为蓼科植物Polyponum cuopicltum Sieb.et Zucc干燥根茎。
       　　2  方法与结果
       2.1  白藜芦醇含量测定方法
       2.1.1  色谱条件色谱柱ODSC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈∶水（0.02%磷酸）30∶70；流速1 ml/min；柱温30℃；检测波长303 nm；20 μl进样环。理论塔板数不低于3 000；分离度大于1.5。
       2.1.2  线性关系考察精密称取干燥白藜芦醇对照品330 μg，置10 ml容量瓶中加甲醇制成浓度33 μg/ml的溶液作为对照品溶液。分别吸取对照品溶液各1，3，5，7，9 μl，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，白藜芦醇对照品进样量换算为浓度值为横坐标，计算线性回归方程为：Y=1.988 8X-0.116 6  （n=0.999 2），其进样浓度值在1.65 ~14.85 μg/ml范围内线性关系良好。
       2.2  提取工艺优选根据初步筛选的结果，按表1设定的因素水平进行正交实验，筛选最佳的工艺条件。
       表1  因素水平(略)
       称取虎杖药材粗粉共9组，每组50 g，按L9（34）正交表的条件进行加热回流提取，将提取液回收乙醇后用75%的乙醇定容置500 ml，从每份中吸取50 ml，用75%的乙醇定容置500 ml；再从中吸取50 ml用甲醇定容置25 ml，滤过，测量每份样品中白藜芦醇的含量，换算成每100 g虎杖所提取出白藜芦醇的量，结果及统计数据见表2~3。直观分析表明在所选因素水平范围内，乙醇浓度对白藜芦醇的提取效果影响最大，提取次数次之，提取时间影响最小；经方差分析乙醇浓度和提取次数具有显著性，故优化工艺为A3B3C2D2，即90%乙醇提取两次，每次10倍量，提取1.0 h。根据所选工艺条件进行3批验证实验，其提取量与表2中最好水平相近，表明该提取工艺稳定可行。
       2.3  分离、纯化工艺将乙醇溶液回收完乙醇后，用15倍量饱和异丁醇萃取，以1 ml/min速度进行AB8大孔吸附树脂吸附，大水洗至流出液无色，再改用20%甲醇洗脱［5］，得甲醇液。回收甲醇，将样品用适量硅胶拌样，上硅胶H柱以石油醚醋酸乙脂（9∶1）洗脱［6］，收集其有蓝色荧光（λ254 nm）的组分，经丙酮重结晶得到无色针状结晶，经与对照品混合熔点测得及HPLC测定，证实为白藜芦醇，其浓度99%以上。
       表2  L9（34）正交实验(略)
       表3  方差分析(略)
       　　3  讨论
       在正交实验中提取2次比3次及提取1.0 h比提取1.5 h的提取效果好，可能是3次提的溶液体积比2次提取的溶液体积大，回收乙醇的时间较长；提取1.5 h所受热时间较长，白藜芦醇长时间受热稳定性较差，所以表现为提取效率下降。该实验采用硅胶柱层脱色素，其产品的收得率有待进一步提高，或采用其他脱色技术，有待进一步研究。
       　　参考文献：
       ［1］  曾建国,侯团章,张  胜.高效液相色谱法测定虎杖提取物中白藜芦醇的含量［J］.中国中医药科技,2000,7(3):175.
       ［2］  黄康泰.常用中药化学成分与活性手册［M］.北京:中国医药科技出版社,1994:1222.
       ［3］  周建军,张宏杰,杨培君,等.汉中地区虎杖中白藜芦醇苷及苷元含量测定［J］.中草药,2002,33(5):414.
       ［4］  王  磊,黄  澜,张  勉,等.虎杖商品药材中白藜芦醇苷的含量测定［J］.中国中药杂志,2002,27(5):344.
       ［5］  曹  庸.虎杖中白藜芦醇提取、纯化技术研究,硕士论文［C］.2001：11.
       ［6］  杨连春,王  峰,刘  敏,等.白藜芦醇的提取分离及其对内皮素1的拮抗作用［J］.华西药学杂志,2000,15(2):81.
       基金项目：湖北省科技攻关资助项目（No.2005AA301C32）
       (湖北中医学院，湖北 武汉  430061；  湖北省宜昌市药检所  443007)