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       【关键词】  消瘢
        摘要：目的：探讨消瘢方对猪血清免疫性肝纤维化的预防作用。方法：60只SD雄性大鼠被随机分为4组：正常对照组、模型组、消瘢方高、低剂量预防组。除正常对照组外，所有大鼠均腹腔注射猪血清(1次/3 d，共12周)，实验结束后处死大鼠，收取血清及肝组织标本，测定谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)、血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)及透明质酸(HA)，利用HE及Masson染色对肝组织纤维化程度进行评价，并观察肝组织胶原的分布及α平滑肌肌动蛋白(α－smooth muscle actin, α－SMA)的表达。结果：消瘢方能显著降低肝纤维化大鼠血清ALT、AST、PCⅢ及HA水平，减少肝组织胶原的分布及α－SMA的表达，能显著改善肝纤维化程度。结论：消瘢方能有效预防肝纤维化的发生、发展，其作用可能与保护肝细胞，抑制细胞外基质合成及HSC活化有关。
        关键词：消瘢方；肝纤维化
        The Preventive Effects of the XiaoBan Recipe on the Hepatic Fibrosis Induced by Porcine Serum
        WU Yayun1, LI Hui2, XIONG Tao1, TONG Tie2
        (1.Department of Infection Disease, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou  550004, China; 2.Maternal and Children Health Hospital of GuiYang,Guiyang, Guizhou 550004, China)
        Abstract:Objective:To investigate the preventive effects of XiaoBan Recipe(XBR)on the hepatic fibrosis induced by porcine serum.Methods:Sixty male SD rats were randomly divided into four groups: normal control group, model group, low-dose-prevented group and high-dose-prevented group. Except the normal control group, the other rats were given an intraperitoneal injection of porcine serum(every three days for 12 weeks).At the same time, the two XBR-prevented groups were dealed with XBR, in the end of the experiment, the serum and livers of all the rats were sacrificd to detect alanine transaminase(ALT),aspartatc aminotransferase(AST), pre-collagenⅢ(PC Ⅲ), hyaluronic acid(HA).Then the degree of hepatic fibrosis was evaluated by HE,Masson stain. The distribution and content of hepatic collagen and α－SMA was observed.Results:XBR could obviously decrease the concentration of serum ALT, AST, PCⅢ and HA of rats with hepatic fibrosis, and reduce the stage of hepatic fibrosis. The distribution and expression of collagen and α－SMA were obviously less in prevented group than that in models group.Conclusion:XBR can prevent the occurrence and development of hepatic fibrosis in rats, the effect may be related to its preventing liver cell against injury, inhibiting the synthesis of extracellular matrix(ECM) and the activation of hepatic stellate cell(HSC).
        Key words:XiaoBan Recipe;Hepatic fibrosis
        纤维化是器官、组织损伤后的常见病理转归。各器官纤维化虽其病变部位不同，但病理形成机制却是相同的，表现为细胞外基质(ECM)合成增多，降解减少，纤维结缔组织增生［1］。消瘢方由半枝莲、白花蛇舌草、断肠草等组成，是贵州省施秉苗族同胞用于外敷治疗疤痕疙瘩的偏方，鉴于中医异病同治理论［2］，本实验旨在探讨消瘢方对肝纤维化有无影响。
           1材料与方法
        1.1材料雄性SD大鼠60只，体重150～170 g，由贵阳医学院动物实验中心提供。猪血清系本室从屠宰场采新鲜猪血自制。消瘢方为细粉末状，由贵州省施秉县苗族老人田兴兰提供，用前用自来水配成所需浓度。血清HA试剂盒购于上海海军医学研究所PCⅢ试剂盒购于重庆肿瘤研究所。α－SMA单克隆抗体(工作浓度为1∶100)及免疫组化ABC试剂盒购于武汉博士德公司。
        1.2方法60只大鼠随机分为4组，正常对照组、肝纤维化模型组及消瘢方高、低剂量预防组(5，0.25 g・kg－1・d－1)，每组15只。除正常组外，各组于实验第1天即予猪血清腹腔内注射诱导肝纤维化模型，每次0.5 ml/只，1次/3 d，共12周。对照组及模型组不给药，其余各组自造模开始，每d灌胃给药。第12周颈动脉放血处死动物，取血分离血清，取肝右叶标本1块，用10%中性甲醛固定。大鼠血清ALT、AST用Beckman全自动生化分析仪测定，PCⅢ、HA检测用放射免疫法。
        1.3肝纤维化分级及胶原纤维的检测肝组织经石蜡包埋切片，作常规HE及Masson染色。参照瞿为溶标准［3］将肝纤维化分为0－Ⅳ级，0级：无肝纤维化；Ⅰ级：纤维结缔组织仅局限于汇管区或汇管区扩大，有向小叶发展倾向；Ⅱ级：纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3及有Ⅰ级同样的改变；Ⅲ级：纤维化结缔组织进入肝小叶中央静脉周围；Ⅳ级：纤维化结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有3级同样改变。每张Masson染色切片随机选取5个视野(10×20倍)，每个视野含一个门管区，通过Biomias图象分析仪(四川大学图象图形研究所产)测定胶原总面积，并计算出其所占视野面积的百分比。
        1.4肝组织α－SMA的表达α－SMA采用免疫组化ACB法检测。每张切片随机选取5个高倍镜视野(10×40)，分别计算肝实质及纤维间隔内α－SMA阳性细胞占细胞总数的百分比。
        1.5统计学处理计量资料以±s表示，采用t检验，肝纤维化程度计数资料采用χ2检验。
           2结果
        2.1血清ATL，AST，PCⅢ及HA的含量消瘢方高、低剂量预防组血清ATL，AST，PCⅢ及HA的含量均低于模型组，消瘢方高剂量预防组四项指标最低，与模型组比较差异显著，高、低剂量预防组间比较亦具显著差异。见表1。
        2.2肝组织学改变及胶原纤维测定结果肝组织病理采用HE、Masson染色显示模型组大鼠肝组织结构紊乱，肝细胞变性、坏死，较多的炎细胞浸润，纤维结缔组织从汇管区延伸至小叶间，形成厚薄不一的网络状的纤维间隔(见图1)。消瘢方预防组虽也有不同程度肝纤维化，但尚有较多结构正常肝小叶结构，肝细胞变性、坏死及炎细胞浸润程度轻，纤维带细、窄、短，多数呈不完全分隔，尤以消瘢方高剂量预防组为明显(见图2)；高、低剂量组间比较，其肝纤维化分级差异无显著性(P＞0.05)。见表2。用图象分析仪扫描Masson染色切片，结果消瘢方高、低剂量预防组的胶原面积百分比均显著小于模型组，高、低剂量预防组间比较有显著差异性(P＜0.05)。见表3。
        表1消瘢方对肝纤维化大鼠血清ALT，AST，PCⅢ，HA含量影响(±s)（略）
        2.3肝组织α－SMA的表达α－SMA在正常对照组肝组织仅分布于血管壁，模型组除血管壁外，汇管区、纤维间隔有大量表达，在肝细胞间血窦内也有分布，呈着色较深的条索状或片状(图3)。消瘢方预防组与模型组比较α－SMA有不同程度减少，α－SMA阳性细胞仅分布于血管壁及汇管区，在肝细胞间血窦内的分布明显减少，呈细线状，着以浅(图4)。肝实质及纤维间隔内α－SMA阳性细胞占细胞总数的百分比见表3。
        图1模型组（略）
        图2消瘢方高剂量预防组（略）
        表2消瘢方对大鼠肝纤维化程度的影响（略）
        表3消瘢方对大鼠肝组织胶原分布面积及α（略）
           3讨论
        肝纤维化是各种致病因素导致大量细胞外基质在肝窦间隙异常沉积的过程，是细胞外基质合成与降解失衡的结果［4，5］，是许多慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程，纤维化是一种可逆的病变［6，7］，如能及时预防性给药，可减少纤维结缔组织在肝脏内的沉积，从而有利于防止肝硬化的发生甚至使肝纤维化逆转。因此，寻找一种成分简单、价格便宜、毒副作用小的抗纤维化药物，一直是国内外学者致力研究的热点。
        免疫性肝纤维化模型较接近人类肝炎后肝硬化形成的原因与表现等优点，是理想的肝纤维化模型［8］。本文通过对猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化模型应用消瘢方进行干预，结果显示：消瘢方预防组肝纤维化程度较模型组轻，提示消瘢方具有预防肝纤维化作用。血清ALT，AST是反映肝细胞炎症和坏死的敏感指标，它的升高在一定程度上反映肝细胞损伤和坏死程度。消瘢方预防组血清ALT，AST的含量明显低于模型组，提示消瘢方具有保护肝细胞，减轻肝细胞炎症，抑制肝细胞变性、坏死的作用，从而减少了肝纤维化的始动刺激因素。细胞外基质有胶原蛋白、蛋白多糖及粘连蛋白三大类，血清PCⅢ，HA分别为前两种细胞外基质成分的代表，是反映肝纤维化程度的敏感指标，能反映肝脏炎症活动度、肝纤维化程度，与肝纤维化程度呈正相关［9］。消瘢方预防组血清PCⅢ，HA的含量及肝组织胶原分布面积明显低于模型组，提示消瘢方具有抑制细胞外基质合成的作用。
        肝星状细胞(HSC)是肝脏中产生胶原等细胞外基质的主要细胞，而肝脏损伤－肝实质炎症、坏死－HSC活化－大量细胞外基质沉积是肝纤维化发生机制的中心环节［10］。Desmin是HSC静止HSC的标志，HSC在活化过程中逐渐丧失Dsemin转而表达α－SMA，因而α－SMA被认为是活化HSC的标准［11］，通过观察α－SMA的表达分布情况，可以了解HSC活化、增殖情况。
        本研究结果显示，α－SMA在猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化模型中明显表达，消瘢方预防组的表达较模型组显著减少，提示消瘢方能显著抑制HSC的增殖、减少活化HSC的数量，从而使得由活化HSC所引发的一系列后果得到改善，有效地防止肝纤维化的发生和发展。
        本研究已初步证明能逆转皮肤纤维化的消瘢方对肝纤维化同样有效，消瘢方具有抗肝纤维化作用，其抗肝纤维化作用可能是通过保护肝细胞、抑制肝细胞变性、坏死，抑制HSC的活化，减少细胞外基质合成而发挥。有关消瘢方的有效作用成分以及对肝纤维化其它环节的影响有待进一步研究。
           参考文献：
        ［1］李健，李或，米建昭.胶原纤维与器官纤维化［J］.解剖学报，2003，34(6)：662664.
        ［2］张东伟，牛建昭，陈家旭.异病同治理论在中医药研究中的几点思考.世界科学技术［J］.中药现代，2003，5(6)；136138.
        ［3］瞿为溶，王泰龄，周小军，等.慢性肝炎的诊断、分级和分期［J］.中华消化杂志，1996，16(5)：277277.
        ［4］辛绍杰，邹正升.细胞外基质的代谢［J］.世界华人消化杂志，2002，10：5456.
        ［5］程明亮，杨长青.肝纤维化的基础及临床，第2版［M］.北京：人民卫生出版社，2002：5254.
        ［6］Pol S,Carnot F,Nalpas B,et al.Reversibility of hepatitis C virusrelated cirrhosis［J］.Hum Pathol,2004，35(1):107112.
        (下转第976页)(1.贵阳医学院附属医院，贵州 贵阳550004；2.贵州省贵阳市妇幼保健院550004)