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       【关键词】  岩黄连；,,基因组DNA；,,SDS
       摘要：目的获取高质量的岩黄连基因组DNA。方法用改进的SDS-CTAB 法从岩黄连叶片中提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、PCR 检测其质量，并与传统的CTAB 法比较。结果通过改进的SDSCTAB 法提取的DNA优于CTAB 法提取的DNA，电泳条带清晰，纯度高，能较好的进行PCR。结论改进的SDSCTAB 法适合岩黄连基因组DNA 的提取。
       关键词：岩黄连；  基因组DNA；  SDSCTAB 法
       Isolation and Analysis of Genomic DNA from Leaves of Corydalis saxicola Bunting
       CHENG Hua， ZHOU Pengpeng*， YU Longjiang， HU Qiongyue， ZHU Lu， LIU Zhi，  AO Mingzhang
       （College of Life Science & Technology, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430074, China）
       Abstract：ObjectiveIn order to obtain high quality genomic DNA of Corydalis saxicola Bunting，an effective method was established. MethodsTwo different methods,CTAB method and improved SDSCTAB method, were applied to isolate genomic DNA from leaves of C. saxicola. The DNA obtained was analyzed by the means of agarose gel electrophoresis, spectrophotometer measurement and PCR.ResultsHigher purity DNA was obtained by improved SDSCTAB method and it showed good response to PCR. ConclusionThe improved SDSCTAB method was favorable for the extraction of genomic DNA from C. saxicola.
       Key words：Corydalis saxicola Bunting;  Genomic DNA;  the SDSCTAB method
   
　　岩黄连（Corydalis saxicola Bunting），紫堇科紫堇属植物，多年生草本［1~3］。全草含脱氢卡维丁（岩黄连碱）等活性成分［4］；具有显著的抗菌、消炎、镇痛和强安定作用，是常用于消炎止痛、排毒，治疗急慢性肝炎和肝硬化等疾病的一种中草药［4，5］。岩黄连分布局限于石灰岩山区，属石山特有种，现在资源极少，被列为中国南部石灰岩稀有濒危植物［3］。为了研究岩黄连的致濒机制，有必要对其遗传多样性进行分析，而岩黄连基因组DNA 提取是在分子水平上对其进行系统分析与研究的基础性工作，获得高质量的DNA 是进行这些工作的必备前提。目前这方面的研究未见报导。由于植物细胞通常含有大量多糖、多酚及次生代谢产物，严重干扰DNA 的抽提，提取完整性好、纯度高的DNA 并非易事。本文用改进的SDSCTAB 法从岩黄连叶片成功抽提出基因组DNA，与传统CTAB 法比较，提取的DNA 纯度高，能较好的进行PCR，为在分子水平研究岩黄连遗传多样性的开展奠定良好基础。
       1  材料与方法
       1.1  材料岩黄连植株采自广西马山县，以新鲜叶片作为实验材料。CTAB、SDS、EDTA、TrisCl 购于Amresco 公司，其他试剂均为国产分析纯。裂解缓冲液（1.0 mol/L NaCl, 50 mmol/L Tris, 50 mmol/L EDTA, pH 8.0）；5×CTAB (5% CTAB，1.0 mol/L NaCl，50 mmol/L EDTA，250 mmol/L Tris，pH 8.0)；TE（1 mmol/L EDTA，10 mmol/L TrisCl，pH 8.0）。
       1.2  方法
       1.2.1  改进的SDSCTAB 法 对SDS-CTAB 法［6,7］进行改进。称取适量经75％乙醇表面消毒的样品于预冷的研钵，加入1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP），液氮研磨，然后收集于离心管；加等体积的65℃预热的裂解缓冲液和4% SDS（W/V），冻融两次，充分溶解后65℃恒温30~40 min；10 000 r/min 离心5 min 去沉淀，量上清液体积，加1/5 倍体积的5×CTAB，65 ℃继续恒温10 min; 加入等体积 5 mol/L 的KAc，冰浴20 min，4℃ 12 000 r/min 离心10 min，转移上清至另一干净的离心管中；加等体积的氯仿/异戊醇 (v/v, 24∶1)  ，缓慢倒转离心管使溶液成为乳状并保持几分钟，12 000 r/min 离心10 min，上清液再转至另一离心管，重复用氯仿/异戊醇抽提两次并离心；上清液转至另一离心管后，加等体积预冷的异丙醇，充分振荡后，于20℃放置2 h，离心沉淀DNA，75%乙醇冲洗3 次，晾干后加适量的TE 溶解，20℃保存待用。
       1.2.2  常规CTAB 法 参考文献方法［8］。
       1.2.3  DNA 质量鉴定参考顾红雅等［8］的方法。取5 μl DNA 样品稀释100 倍后在紫外分光光度计(日本岛津UV 240)上测定230，260 nm 和280 nm 时的吸光度值，并计算其比值和产量。另取5 μl DNA样品在0.8%的琼脂糖凝胶 (含有溴化乙锭)上电泳, 胶块经凝胶成像系统（BioRad geldoc 2000 system）扫描存档。
       1.2.4  PCR 检测以两种方法提取的基因组DNA 为模板，植物18S 通用引物(上海申友公司合成)：P1，5"CAA CCT GGT TGA TCC TGC CAG T3"；P2，5"CTG ATCCTT CTG CAG GTT CAC CTA C3"。在PCR 仪（Biometra T1 Thermocycler）上进行PCR 反应，采用TaKaRa 的PCR 试剂盒，其中TaKaRa Taq 聚合酶0.5 μl，10×PCR buffer 5 μl，dNTP Mixture (10 mmol/L each) 2  μl，25 mmol/L 上下游引物各1 μl,模板DNA 2 μl，总体积50 μl。反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 1 min， 48～56℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 个循环；72℃ 10 min。然后取PCR 产物10 μl在0.8%琼脂糖凝胶上电泳, 胶块经凝胶成像系统扫描存档。
       　　2  结果
       2.1   DNA 提取结果采用改进的SDSCTAB 法提取的DNA 外观上为白色沉淀，而CTAB 法提取的DNA 带少许褐色，表明CTAB 法提取的DNA 中有少许酚类物质被氧化。从表1 可以看出，由改进的SDSCTAB 法得到的的岩黄连叶片基因组DNA 提取液的OD260/OD280 均在1.8～2.0 之间，说明提纯效果较好，没有蛋白质等大分子的污染；260 nm 和230 nm 下的吸光度值之比在2.0～2.1 之间，表明DNA 提取液中基本上没有残存的小分子杂质；图1 的结果也显示SDSCTAB 法提取的DNA 条带清晰单一，大小20kb 左右，没有发生断裂，也没有RNA、多糖等杂质污染。而CTAB 法提取的DNA 样品OD260/OD280 值在2.0 以上，电泳照片显示3 条带（图1），上面一条为DNA，下面2 条为杂带，表明有RNA 污染；OD260/OD230 值在2.0 以下，说明还存在小分子或盐类杂质。改进的SDSCTAB 法提取DNA 的产量为(222.5±2.9) μg/g (鲜叶片)，CTAB 法提取的DNA 产量由于污染无法精确计算。
       表1  两种不同方法提取的岩黄连基因组DNA（略）
       1,2：改进的SDSCTAB法提取的岩黄连基因组DNA；  3，4：CTAB 法提取的岩黄连基因组DNA
       图1  岩黄连DNA的电泳图（略）
       2.2  PCR 检测如图2 所示，1，2，3 是以CTAB 法提取的DNA 为模板，退火温度为48℃，PCR 扩增的结果，未见明显条带，表明DNA 模板的纯度不够，影响PCR 反应的进行。4～12 是以SDSCTAB 法提取的DNA 为模板，不同退火温度下的PCR扩增结果，其中4, 5, 6 的退火温度为48℃，7, 8, 9 的退火温度为52℃，10, 11, 12的退火温度为56℃；48℃扩增时，出现明显的非特异性扩增，呈现3 条带；52℃时，扩增效果好，扩增出来的条带单一而且亮度高，说明退火温度的提高有助于减少了非特异性扩增；56℃时，扩增效果较好，但条带亮度减弱，可能是由于退火温度的进一步升高，导致引物与模板退火不完全，导致产物减少所致。结果表明改进SDSCTAB 法提取的DNA 模板质量高，能较好的进行PCR 反应，在合适的退火温度下，可扩增出理想条带；而CTAB 法提取的DNA 模板没有扩增出明显条带，说明DNA 质量不高，不能进行有效扩增。
       图2   岩黄连基因组DNA 的PCR 产物图（略）
       　　3  讨论
       随着分子生物学技术的不断发展，提取植物的基因组DNA 进行PCR 扩增、基因克隆、RAPD、AFLP、SSR 及ISSR 分析显得越来越重要，而获得高质量的DNA 是必备的前提。基因组DNA 的提取过程，可以简单分为3 个连续的步骤：(1)细胞破壁，植物细胞具有坚韧的细胞壁，这是提取过程中必须克服的障碍，适当的前期处理会对后面结果造成明显影响；(2)去除杂质，包括蛋白质、多糖、RNA等，这一步直接关系到提取的质量；(3)沉淀DNA，通常用预冷的乙醇或异丙醇沉淀DNA，得到纯化的产物。在植物组织提取DNA 过程中，多酚、多糖及其他次生代谢产物，能和核酸发生不可逆的结合，如果处理不当，就会严重抑制内切酶和DNA聚合酶的作用，从而影响后续的研究工作［9］。由于不同植物及同一植物不同组织的结构及生化成分各不相同，而这些结构和成分上的差异对DNA 的不同提取方法往往会造成不同程度的影响，导致了不同方法所得的DNA 在纯度和质量上的明显差异［10］。因此，在实际工作中，应根据实验材料的特点，建立适当的提取方法。针对岩黄连叶片中含有大量的蛋白、酚类物质、多糖以及丰富的次生代谢物质，对SDSCTAB法进行了改进，主要体现在以下几个方面： 在研磨时加入PVP，防止酚类物质和其他次生代谢物质的干扰，PVP 不但可有效吸附色素类物质，而且还可以起到石英砂的作用，有助于样品的粉碎［11］；可溶性PVP 进入缓冲液之后可以以氢键方式与多酚、萜烯和单宁类物质结合，阻止这些物质与核酸作用，对抑制多酚氧化酶和细胞色素氧化酶也能起到很好的效果，从而防止DNA 褐变［12］；采取两次冻溶步骤，利用热胀冷缩的原理使绝大部分细胞破壁，以弥补液氮研磨之不足［11］，提高DNA 的提取量；中期去除杂质时，加入高浓度的KAc（5 mol/L）在低温的情况下可以达到去除多糖类物质的效果；增加用氯仿/异戊醇的抽提次数来达到完全去除蛋白质的目的，经过连续3 次抽提后，两相界面中间已没有由蛋白质等物质形成的白色层；后期DNA 沉淀时，没有使用无水乙醇，改用沉降效果较好的异丙醇，并延长静置时间，使得DNA 能够完全沉淀出来。电泳条带清晰明亮(图1)，无拖尾杂带现象，得到的DNA 质量好、纯度高。PCR检测也说明在合适的退火温度下，改进的SDSCTAB 法提取的DNA 可以扩增出理想的条带（图2）。而采用CTAB 法提取的DNA 存在RNA 污染，PCR 扩增不出明显条带，表明所提DNA 质量不高。此外，改进的SDSCTAB 法耗时短，操作简便，易于推广使用。同时，我们发现只要使样品充分裂解，无论是成熟的老叶还是幼嫩的新叶或者茎，都可以得到较好的DNA 提取物，说明该法对岩黄连不同组织有较好的通用性。
       　　参考文献：
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       (华中科技大学生命科学与技术学院，湖北  武汉  430074）