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       【关键词】  薄层扫描法；,,尘肺清颗粒；,,黄芪甲苷；,,含量测定
       摘要：目的测定尘肺清颗粒中黄芪甲苷的含量。方法用薄层扫描测定尘肺清颗粒中黄芪甲苷含量。结果黄芪甲苷的线性范围为1.00～8.00μg，平均回收率为98.2%,RSD为1.15％；测得三批尘肺清颗粒中黄芪甲苷的平均含量为0.285 mg/g。结论 方法简便、准确、快速、重现性好，可作为该制剂的质量控制标准。
       关键词：薄层扫描法；  尘肺清颗粒；  黄芪甲苷；  含量测定
       Determination of Astragaloside Ⅳ in Chenfeiqing Granules by TLCscanning
       LIANG Ruixue， ZHANG Xinjun， JIA Yuanyin， FENG Ying
       (Shandong Acadamy of Chinese Medicine,Jinan 250014,China; Shandong Normal University, Jinan 250014, China）
       Abstract：ObjectiveTo establish a method of determination of Astragaloside Ⅳ in Chenfeiqing Granules. MethodsThe content of Astragaloside Ⅳ was assayed by TLCscanning.ResultsAstragaloside Ⅳ showed a linear relationship at the range of 1.00～8.00 μg, the average recovery was 98.2%，RSD=1.15%(n＝5).ConclusionThe method is simple,accurate,quick and good reproducible.It can be used for the determination of Astragaloside Ⅳ in Chenfeiqing Granules.
       Key words：TLCscanning;  Chenfeiqing Granules;  Astragaloside Ⅳ;  Determination Content
   
　　尘肺清颗粒为正在研制的中药新药，对尘矽肺患者具有很好的疗效。黄芪为该处方的君药，其所含黄芪甲苷为黄芪的主要有效成分，故以黄芪甲苷为指标，参考有关文献［1~5］，采用薄层扫描法对该制剂中的黄芪甲苷进行了含量测定方法的研究，通过方法学的系统考察和三批样品的含量测定，建立了本品中该成分的含量测定方法，实验方法如下。
       　　1  材料
       1.1  仪器与试药CS9301型薄层扫描仪（日本岛津公司），定量毛细管（日本岛津公司），薄层自动铺板器（重庆南岸新力实验电器厂），硅胶G（青岛海洋化工厂），D101型大孔树脂（天津农药总厂），氢氧化钠、甲醇、正丁醇等所用试剂均为分析纯。黄芪甲苷由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用（批号为07819505）。
       1.2  样品来源及处理黄芪及处方其它药材均购自济南市建联药材供应站，经鉴定均为药典正品，3批尘肺清颗粒中试样品由本课题组研制。
       　2  样品溶液提取时间及纯化条件的研究
       2.1  供试品提取时间的确定称取相同量的同批尘肺清颗粒6份，每份约4.0 g(相当于黄芪药材1.7 g)，精密称定，置索氏提取器中，用氯仿脱脂2 h后，各加入甲醇100 ml，分别提取3，4，5 h，依法测定相同点样量各样品中黄芪甲苷的测定值，发现3 h提取的样品中黄芪甲苷的测定值偏低，而4 h提取的样品中黄芪甲苷的测定值与5 h基本接近，这表明4 h即可基本提取完全，故提取时间确定为4 h。
       2.2  纯化条件的确定取本品细粉2份，每份约4.0 g，精密称定,各加入硅藻土3 g拌匀,置索氏提取器中,加氯仿100 ml回流脱脂2 h,取出,晾干后加甲醇100 ml,回流提取4 h,放冷,过滤,回收溶剂至尽,残渣加水40 ml,微热使溶解,以水饱和的正丁醇提取4次（40，40，30，30 ml），合并正丁醇萃取液，其中一份用氨试液洗涤2次，50 ml/次，弃去氨试液，正丁醇液挥干，残渣以5~7 ml80%乙醇溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm,长20 cm）,以蒸馏水80 ml洗脱,弃去水洗脱液,再用40%乙醇60 ml洗脱,弃去,最后用70%的乙醇160 ml洗脱,收集洗脱液,水浴蒸干,残渣以甲醇溶解,并定容于2 ml量瓶中,作为供试品溶液①。另一份用2%NaOH洗涤2次,60 ml/次,弃去NaOH液, 正丁醇液再用正丁醇饱和的水100 ml洗涤1次,弃去水液,正丁醇液水浴蒸干,残渣以甲醇溶解并定容至2 ml,摇匀,作为供试品溶液②。依法测定相同点样量供试品液①和②中黄芪甲苷的含量，结果表明两种方法均能有效的去除杂质对黄芪甲苷的干扰，层析后显色斑点前后分离完全，无杂质样干扰，两种方法的测定值较接近，但碱洗法较大孔树脂法更简便，故实验中确定采用2%NaOH溶液洗涤正丁醇萃取液进行纯化。
       　　3  样品溶液的制备
       3.1   供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物约4.0 g，精密称定，加硅藻土3g,拌匀，置索氏提取器中，加氯仿100 ml回流提取2 h脱脂，取出，晾干后，再置索氏提取器中，加甲醇100 ml，回流提取4 h，放冷，滤过，回收溶剂至干，残渣加水40 ml，微热使溶解，并转移到分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取4次（40，40，30，30 ml），合并四次正丁醇萃取液，用2%NaOH试液洗涤2次（60，60 ml），弃去氢氧化钠试液，再用正丁醇饱和的水100 ml洗涤1次,正丁醇液蒸干，残渣以甲醇溶解，并定容至2 ml量瓶中，作为供试品溶液。
       3.2  对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品2.0 mg，用甲醇溶解并定容至2 ml量瓶中，摇匀，作为对照品溶液。
       3.3  黄芪对照药材溶液的制备取黄芪药材粉末约1.7 g，精密称定，模拟本品的制备工艺和供试品的制备方法，制成黄芪药材对照液2 ml。
       3.4  缺黄芪空白对照液的制备按处方比例称取除黄芪外的其它各药材，按样品的制备工艺及供试品溶液的制备方法，制得缺黄芪空白对照液2 ml。
       　　4  薄层层析条件的选择
       薄层板：硅胶G薄层板20 cm×20 cm×0.4 mm，110℃活化30 min，置干燥器中，备用；展开剂：氯仿甲醇水（13 ∶6 ∶2 V/V）10℃以下放置过夜的下层液；显色剂：10%硫酸乙醇液喷雾，90～100℃烘至斑点清晰（约5～7 min）。经过多种薄层层析条件的筛选，发现样品在上述条件下，分离效果较理想，黄芪甲苷斑点圆而清晰，前后分离完全，无杂质点干扰，Rf值亦较适中（Rf=0.35）。
       1.供试品   2.黄芪甲苷  3.黄芪药材  4.缺黄芪空白
       图1  供试品中黄芪甲苷的TLC图（略）
       　　5  样品的含量测定
       5.1  测定条件测定波长λS = 520nm，参比波长λR= 700nm，狭缝0.4 mm×0.4 mm，线性化参数SX=3。
       5.2  最大吸收波长的选择将层析后的供试品、对照品在370～700 nm范围内扫描，绘制吸收曲线，结果二者均在520 nm处有最大吸收，故测定波长确定为520 nm,参比波长为700 nm。
       5.3  空白干扰实验按含量测定条件，对点样层析后的供试品、黄芪甲苷及缺黄芪空白液的各斑点分别在λS =520nm，λR =700 nm进行扫描，画出吸收曲线，结果表明，缺黄芪空白液在与黄芪甲苷对应位置上无明显吸收峰，基本为一平线，而供试品在与黄芪甲苷相对应位置上有明显的吸收峰，这表明本测定无明显干扰。
       5.4  线性关系考察  准确吸取黄芪甲苷对照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 μl点于同一薄层板上，按选定的色谱条件，展开、显色，扫描测定，以点样量（μg）为横坐标，峰面积积分植（A）为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明，黄芪甲苷在1.00～8.00 μg范围内，点样量（μg）与峰面积积分值（A）呈良好的线性关系，对所得数据进行处理得回归方程Y=680.61X+119.62，相关系数r=1.000
       5.5  精密度实验
       5.5.1  同板精密度实验准确吸取对照品溶液3 μl，供试品溶液4 μl,在同一薄层板上各点5个相同量的点，依法测定各斑点的峰面积积分值并计算精密度，结果供试品平均峰面积积分值为3 654.2±44.2，RSD＝1.21％，表明同板精密度良好。
       5.5.2  异板间精密度实验准确吸取对照品溶液2，4 μl，供试品溶液4 μl,分别点于5块薄层板上，依法测定，计算各板样品中黄芪甲苷的含量，并计算各板间的精密度，结果样品的平均含量为0.284±0.006 937，RSD＝2.44％，表明异板精密度良好。
       5.6  稳定性实验对层析后的黄芪甲苷对照品和供试品斑点进行稳定性实验考察，测定峰面积积分值，每隔20 min测定1次，连续测定6次，结果表明对照品和供试品斑点在测定时间100 min内斑点颜色比较稳定，峰面积积分值基本不变，供试品峰面积 RSD＝1.49％，对照品峰面积RSD＝1.27％。
       5.7  重现性实验取同一批颗粒样品6份，每份约4.0 g，精密称定，依法测定各样品中黄芪甲苷的含量，结果6次测得的平均值 为0.286±0.006 53，变异系数RSD=2.89%，表明重现性良好。
       5.8  回收率实验 称取已知含量的同批颗粒样品5份，每份约2 g，精密称定，各加入黄芪甲苷对照品0.573 mg，按供试品液的制备方法制备回收率实验液，依法测定各实验液中黄芪甲苷的含量，并计算回收率，结果5次测定的平均回收率为98.3%，变异系数为1.15%。结果见表1。
       表1  加样回收率实验结果（略）
       5.9  样品的含量测定  精密吸取3批供试液各4 μl，分别点于三块薄层板上，每个样品点5个相同量的点，并随行黄芪甲苷对照品2，4 μl，用外标二点法测定并计算各样品中黄芪甲苷的含量。结果见表2。
       表2  3批中试样品的含量测定结果（略）
       　　6  小结与讨论
       6.1   测得3批尘肺清颗粒中黄芪甲苷的含量分别为0.286 ，0.276，0.292 mg/g,样品回收率为 98.2% ,变异系数为1.15%。
       6.2  本实验曾采用氨试液洗涤,上大孔树脂柱的方法纯化供试品溶液,但此法较2%NaOH洗涤纯化略繁琐, 且纯化效果与本碱洗法较接近，故未采用。
       6.3  本文采用薄层扫描法测定样品中黄芪甲苷的含量,方法简便、重现性好、灵敏度高，适用于测定黄芪及制剂中黄芪甲苷的含量。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000： 249，57，112，168.
       ［2］  阴  健，郭力弓，郑虎占，等.现代中药研究与临床应用Ι［M］.北京：学苑出版社 ，993，592.
       ［3］  王宝琴.中成药质量与标准物质研究［M］.北京：中国医药科学出版社，1994：241，285，288，340，373.
       ［4］  鲁  静，王宝琴.黄芪甲苷的薄层扫描法［J］.中成药，1992，14（6）：34.
       ［5］  李连达，何夏秋.高效薄层扫描法测定中风脑脉通口服液中黄芪甲苷的含量［J］.中国中药杂志，1991，16(2):90.
       (山东省中医药研究院，山东 济南  250014；  山东师范大学，山东 济南  250014)