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       【关键词】  柴胡；,,高效液相色谱
       摘要：目的制定柴胡药材中柴胡皂苷a、d的含量测定方法。方法用高效液相色谱蒸发光散射检测法（HPLCELSD）, Alltima C18色谱柱, 流动相甲醇水（80∶20）,速度0.8 ml・min1；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度40℃，气压3.5bar。结果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分别在1.908~19.08μg（r=0.999 6）和1.804~18.04 μg（r=0.999 2）范围内线性关系良好, 平均回收率分别为98.35%（RSD=1.26%）和97.64%（RSD=1.58%）。 结论 该方法简便、灵敏、可靠、准确、重现性好, 可作为柴胡药材的质量控制方法。
       关键词：柴胡；  高效液相色谱蒸发光散射检测法；  柴胡皂苷
       Determination of Saikosaponin a,d in Radix Bupleuri by HPLCELSD
       WANG Guangzhong，  LI Qiuyi， ZHANG Lianping， LIU Yanwen*
       (Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China)
       Abstract：ObjectiveTo determine saikosaponin a,d in Radix Bupleuri by HPLCELSD. MethodsHPLCELSD was used in the quantitative analysis by using Alltima C18    chromatography column and methanolwater(80∶20) as a mobile phase. The flow rate of mobile phase was 0.8 ml・min1. The tube temperature of the detector was 40℃. The press of pure air was 3.5bar. ResultsThe linear ranges for saikosaponin a and d were 1.908~19.08μg（r=0.999 6）and 1.804~18.04μg（r=0.999 2）, the average recoveries were 98.35% (RSD=1.26%)and 97.64%(RSD=1.58%), respectively. ConclusionThis method is easy, sensitive ,reliable, accurate ,reproducible and can be used as the quality control method of Radix Bupleuri.
       Key words：Radix Bupleuri;  HPLCELSD;  Saikosaponin
   
　　柴胡药材来源于伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根。为常用中药,在我国已有2 000多年药用历史,具有和解表里、疏肝、升阳之功效［1］。 其主要有效成分为柴胡皂苷,其中柴胡皂苷a，d的活性较强,具有抗炎、保肝、降低血中胆固醇等药理活性［2］。 应用高效液相色谱法测定柴胡皂苷a，d含量的报道较多［3，4］。但由于检测波长在210 nm,杂质峰干扰十分严重,检测灵敏度低,影响了含量测定的准确性。本文应用HPLCELSD法同时测定柴胡皂苷a，d的含量, 其杂质峰干扰小,分离度好, 灵敏度高,出峰时间短,便于操作。
       　1  仪器与试药
       高效液相色谱仪：Agilent 1100系统，SEDEX75型蒸发光散射检测器；超声波清洗机（中国华南超声波设备厂），工作频率25 kHz，功率250 w。柴胡皂苷a，d对照品购自中国药品生物制品检定所，含量测定用,批号分别为110777200303和110778200402；甲醇为色谱纯（CALEDON LABORATORIES LSD.），水为重蒸水，其它试剂均为分析纯；柴胡药材经鉴定为柴胡Bupleurum chinense DC.的根。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件 色谱柱为Alltima C18(250 mm×4.6 mm,5 μm); 流动相：甲醇水（80∶20）；速度 0.8 ml・min1，柱温25℃；检测器参数：漂移管温度40℃，气压3.5bar。在选定的条件下，柴胡皂苷a、d对照品与样品中其它组分色谱峰可基线分离，峰形好。按柴胡皂苷d峰计算，理论板数为3 000以上。柴胡皂苷a，d对照品，供试品的高效液相色谱图见图1。
       1. 柴胡皂苷a  2. 柴胡皂苷d   a供试品图谱  b对照品图谱
       图1  高效液相色谱图（略）
       2.2  对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷a 9.54 mg和柴胡皂苷d 9.02 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
       2.3  供试品溶液的制备取柴胡药材粉末（过60目筛）约1g，精密称定，置25 ml量瓶中，加入5%氨水甲醇20 ml，超声处理40 min，放置至室温，加5%氨水甲醇至刻度，摇匀，静置，精密吸取上清液20 ml置蒸发皿中，水浴蒸干，加甲醇溶解，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
       2.4   线性关系考察  分别精密吸取柴胡皂苷a和d的混合对照品溶液2，5，10，15，20 μl注入高效液相色谱仪中，分别测定柴胡皂苷a和d的峰面积。以峰面积自然对数值为纵坐标，进样量的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线。柴胡皂苷a在1.908~19.08 μg范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=5.897 2+1.533 6X，r=0.999 6；柴胡皂苷d在1.804~18.04 μg范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=5.861 9+1.496 5X，r=0.999 2。
       2.5  精密度实验精密吸取对照品溶液10 μl，按上述色谱条件重复进样5次，测定峰面积，结果柴胡皂苷a和d的RSD分别为1.18%和1.53%，表明仪器的精密度良好。
       2.6  稳定性实验取样品溶液, 按含量测定方法及色谱条件分别置0，2，4，6,8 h测定，结果柴胡皂苷a和d的RSD分别为1.29%和1.68%，表明样品溶液在8 h内稳定。         
       2.7  重复性实验精密称取同批号样品6份，按含量测定方法及色谱条件进行测定，结果样品中柴胡皂苷a和d的平均含量分别为11.454 1，8.361 2 mg・g1，RSD分别为1.34%和1.82%。
       2.8   回收率实验 采用加样回收法，，取已知柴胡皂苷a，d含量的样品6份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入柴胡皂苷a对照品6.054 4 mg和柴胡皂苷d对照品4.462 1 mg，按含量测定方法及色谱条件进行测定，结果柴胡皂苷a和d的平均回收率分别为98.35%（RSD=1.26%）和97.64%（RSD=1.58%）。
       2.9  样品测定取不同批号的药材，按上述供试液的制备方法制备供试液。精密吸取对照品溶液5，20 μl及供试品溶液10 μl，分别注入液相色谱仪，按外标两点法测定柴胡皂苷a，d含量，结果见表1。
       　3  讨论
       3.1  柴胡皂苷a，d为柴胡的主要有效成分, 但在提取过程中其结构易发生变化,因此，严格控制提取条件十分重要。本实验比较了甲醇、 5%吡啶甲醇、 5%氨水甲醇的提取效果。结果表明，5%氨水甲醇溶液超声提取效果最佳。
       表1  样品含量测定结果（略）
       3.2  采用5%氨水甲醇溶液超声处理，分别测定了不同提取时间（20，30，40，50 min）样品中柴胡皂苷a，d的含量，结果在40～50 min内样品中柴胡皂苷a、d的含量基本不变。故文中采用超声40 min的方法。
       3.3  本文采用HPLCELSD法测定柴胡中柴胡皂苷a，d的含量, 较采用紫外检测器检测, 能明显减少杂质峰的干扰, 峰形好, 出峰时间短, 有利于提高检测的准确度和工作效率。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：198.
       ［2］  张  本. 柴胡属植物药理作用研究概况［J］.吉林中医药，1983，3(1):39.
       ［3］  王  鹏，贾凌云，孙启时，等. 不同产地柴胡中柴胡皂苷的含量测定［J］.沈阳药科大学学报，2004，21(3):193.
       ［4］  林东昊，茅仁刚，王智华，等. 23种国产柴胡属植物中柴胡皂苷a、c、d含量的RPHPLC测定［J］. 药物分析杂志，2004，24(5):479.

　　(湖北中医学院，湖北 武汉  430061)