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       【关键词】  高脂血症；,,低密度脂蛋白；,,受体；,,化痰活血方
       摘要：目的观察化痰活血方对高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影响，从分子水平探讨该方的降脂作用机理。方法采用高脂乳剂建立大鼠高脂血症模型后给予化痰活血方，应用逆转录―聚合酶链反应（RTPCR）法测定大鼠肝低密度脂蛋白受体（LDLR mRNA）水平。结果化痰活血方能显著增加高脂血症大鼠肝脏LDLR mRNA的表达，与模型组比较有显著性差异（P<0.05或P＜0.01）；结论化痰活血方降脂作用机理可能是通过提高高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因的表达，从而起到降脂作用。
       关键词：高脂血症；  低密度脂蛋白；  受体；  化痰活血方
       The Effect of Huatan Huoxue Fang on Hepatic Low Density Lipoprotein Receptor Gene Expression in Hyperlipidemia Rats
       YE Yong， MEI Guoqiang， LIU Songlin， SHI Tuo， YONG Xuelian， ZHANG Maolin， MEI Jie
       （Department of Traditional Chinese Medicine, School of Medicine and Life Science, Jianghan University, Wuhan 430056, China; Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, China; Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430014, China）
       Abstract：ObjectiveTo explore the molecular mechanism of Huatan Huoxue Fang in prevention on lipid metabolism disorders in hyperlipidemia rats.MethodsFed the rats with lipidemia emulsion to establish the hyperlipidemia model, then applied Huatan Huoxue Prescription. The levels of liver LDLR mRNA were measured by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). ResultsThe results of RTPCR showed Huatan Huoxue Fang could upregulated hepatic LDLR mRNA levels, which showed obvious difference from the model group（P<0.05 or P＜0.01）.ConclusionHuatan Huoxue Fang  may prevent lipid metabolism disorders through upregulation of LDLR transcription level.
       Key words：Hyperlipidemia;  Low Density Lipoprotein;  Receptor;  Huatan Huoxue Fang
   
　　化痰活血方是在《伤寒论》小陷胸汤基础上化裁而来，临床应用于高脂血症、冠心病的治疗取得了满意的疗效［1］。前期的动物实验研究结果表明，化痰活血方可以显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG、LDLC、ApoB水平，升高血清HDLC、HDL2C、ApoAI、的水平，具有较好的降脂作用［2］。为了从更深层次揭示化痰活血方降脂作用机理，本研究拟应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术，观察化痰活血方对高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影响，旨从分子水平揭示该方的降脂作用机理。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  动物健康Wistar大鼠60只，雄性，体重(230±20)g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供（合格证号TJLA2003177）。随机分为空白组、高脂血症模型组、力平脂组、化痰活血方大、中、小剂量组（简称为大、中、小剂量组），每组10只。
       1.1.2  药物及试剂 化痰活血方由法半夏、全栝蒌、黄连、当归、土鳖虫、山楂等组成(均购于武汉市药材公司)，根据各药的有效成分，用不同浓度乙醇渗漉，全部药渣合并煎煮3次，回收乙醇合并全部药液，浓缩为含生药4 g/ml浓度的药液；力平脂（法国利博福尼制药公司，批号为69660），使用前用生理盐水配成1.8 mg/ml混悬液。胆固醇、胆酸钠（美国Sigma公司）；甲基硫氧密啶（北京市燕京制药厂），丙二醇、吐温80（湖北医药公司化学试剂分公司）；TRIzol Reagent Total RNA试剂盒（美国Invitrogen公司）；PCR试剂盒（宝生生物有限公司）；LDLR（5"AAC TAG ACT GCT CCC CCA AGA C3"；5"CTG CGA TGG ATA CAC TCACTA CTG3"）；内参照GAPDH由北京奥科生物技术有限公司合成。
       1.1.3  主要实验仪器 Primus 96 Plus PCR仪（德国MWG Biotech公司）；Hoefer SE 600垂直电泳系列（Hoefer科学仪器公司）；凝胶自动成相仪（GDS 8000，美国）。
       1.2  方法
       1.2.1  动物造模参照文献［2］方法制备高脂乳剂，即10％胆固醇、20％猪油、2％胆酸钠、1％甲基硫氧嘧啶、20％吐温80、30％丙二醇加水至100％制成脂肪乳。除空白组外其余各组大鼠以高脂乳剂10 ml/（kg・d1）灌胃，1次/d，灌服30 d。
       1.2.2  给药方法及标本处理 大鼠造模的第11天各组分别给予相应药物灌胃。给药剂量按药理实验方法学［3］计算，化痰活血方大、中、小剂量组分别按20.16，10.08，5.04 g/kg的标准灌服；力平脂组按0.018 g/kg的标准灌服，空白组及模型组以10 ml/kg的标准灌服生理盐水。1次/d，连续20 d。第21天起，末次给药前禁食12h，给药1h后，用20％乌拉坦0.5 ml/100 g体重麻醉，切开腹部迅速取肝脏，液氮冻存。
       1.2.3  LDLR mRNA的检测 将冻存的肝组织剪碎，采用Trizol常规一步法提取总RNA，然后测定RNA样品含量及纯度：A260/A280=1.8～2.0，说明其纯度满足分子生物学实验的要求。RTPCR法分别扩增LDL-R及GAPDH mRNA，取10 μl PCR反应产物，在2%琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙锭）中电泳，以DL 2 000为分子量标准，电泳缓冲液为1×TAE，电泳完毕后，在凝胶自动成像仪上进行照像、数据分析。经凝胶密度扫描系统处理，测定各电泳带灰度值。待测基因mRNA 相对表达量以其扩增带吸光度值与相应内参照扩增带吸光度值的比值表示。LDLR mRNA相对量=LDLR电泳带灰度值/GAPDH电泳带灰度值。
       1.2.4  统计学处理 用SPSS10.0统计软件进行统计，数据以均数±标准差（±ｓ）表示，t检验，以P＜0.05为有统计学意义。
       　2  结果
       化痰活血方对高脂血症大鼠肝脏LDLR mRNA表达的影响：RTPCR后，琼脂糖凝胶电泳在340 bp处显示出LDLR阳性电泳带，在309 bp处显示出GAPDH电泳带（图1）。从表1可见，模型组大鼠肝脏LDLR mRNA的表达显著降低，与空白组比较有显著性差异（P＜0.01）。化痰活血方各剂量组及力平脂组LDLR mRNA的表达均显著升高，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。其中化痰活血方大剂量组LDLR mRNA相对含量高于中剂量组和小剂量组，提示在3个剂量组中以大剂量的疗效为佳。化痰活血方大剂量组LDLR mRNA相对含量与西药与力平脂组比较，无显著性差异（P＞0.05）。提示化痰活血方具有上调LDLR mRNA的作用，大剂量化痰活血汤与力平脂的作用相当。
       表1  化痰活血方对高脂血症大鼠肝脏LDLR mRNA表达的影响（略）
       与空白组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，★★P＜0.01；与力平脂组比较，▲P＜0.05；n=10
       M：marker；  1：空白组；  2：模型组；  3：大剂量组；4：中剂量组；  5：小剂量组；  6：力平脂组
       图1  化痰活血方对LDLR mRNA转录水平的影响。（略）
       上图为经RTPCR扩增后的大鼠肝组织LDLR(340bp)电泳带；下图为经RTPCR扩增后的大鼠肝组织GAPDH(309bp)电泳带，作为内参照
       　　3  讨论
       高脂血症是临床多发病、常见病，也是动脉粥样硬化、冠心病的主要危险因素之一。近年研究表明，血脂失调症患者存在LDLR功能缺陷和不同程度的损伤，不仅家族性高胆固醇血症患者有LDLR功能缺陷，而且无家族性高胆固醇血症患者中也有相当一部分与LDLR功能缺陷有关［4］，导致血清中低密度脂蛋白水平升高，形成动脉粥样硬化。人血中70%的胆固醇由低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)携带。循环中低密度脂蛋白胆固醇主要是通过肝脏低密度脂蛋白受体途径清除的，因此肝脏LDLR表达的高低能够决定并反映血中胆固醇的代谢水平［5］。LDL通过携带的ApoB100的ApoE与肝细胞表面的LDLR结合，被细胞内吞分解成氨基酸和游离胆固醇。当细胞内游离胆固醇过多时，不但在多个水平抑制内质网3羟基3甲基戊二酰辅酶(3hydroxy3methylglutarylCoA，HMGCoA)还原酶以减少细胞本身胆固醇的合成，而且在转录水平抑制细胞LDLR蛋白的合成，LDLR数目减少，从而减少细胞对LDL的进一步摄取。研究表明，一些降脂药物如洛伐他汀、非诺贝特能增加LDLR的数量以降脂。随着对降脂中药研究的不断深入，发现有些单味中药、中药复方其降脂作用机理与提高LDLR基因表达，解除LDLR的抑制状态，使血中LDLC减少，从而调控血脂水平。如山楂及山楂酮能提高高脂血症大鼠肝LDLR mRNA的水平［6］；调肝导浊中药能升高实验性高胆固醇大鼠肝细胞LDLR mRNA水平［7］。化痰活血方可以显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG、LDLC、ApoB水平，升高血清HDLC、HDL2C、ApoAI的水平［2］。为了更进一步探讨化痰活血方的调节脂质代谢的作用机理，笔者从分子水平观察了化痰活血方对高脂模型大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影响，结果进一步表明，化痰活血方可以解除高脂血症时对LDLR转录的抑制作用。其中化痰活血方大剂量组LDLR mRNA相对含量高于中剂量组和小剂量组，提示在3个剂量组中以大剂量的疗效为佳。而化痰活血方大剂量组LDLR mRNA相对含量与力平脂组比较差异无显著性（P＞0.05），提示二者在分子水平上对增强LDLR基因表达的作用相近。综上所述，化痰活血方可能通过增强肝脏LDLR mRNA表达，继而促进LDLR蛋白合成，增加了肝表面的LDLR数量与活性，增强肝脏对脂质等代谢功能，加快血中LDLC的清除，加速脂蛋白分解，从而起到了调控血脂水平的作用。这可能是化痰活血方调节脂质代谢的作用机理之一。
       　　参考文献：
       ［1］  叶  勇，梅国强.梅国强教授运用化痰活血法治疗高脂血症［J］.光明中医，2003，18(6):22.
       ［2］  叶  勇，梅国强，刘松林，等.化痰活血方对高脂血症大鼠血脂代谢的影响及其抗氧化作用［J］.时珍国医国药，2005， (10):968.
       ［3］  徐叔云. 药理实验方法学，第2版［M］.北京：人民卫生出版社，1991：1136.
       ［4］  秦树存，王士雯. 低密度脂蛋白受体缺陷的诊断与治疗［J］.心血管学进展，1995，16(1):22.
       ［5］  Stlning TM，Klocker H，Harwood HJ.In vivo LDL receptor and HMGCoA reductase regulation in human lymphocytes and its alteration during aging［J］.J Arteriosocler Thromb Vasc Biol,1995,15:872.
       ［6］  林秋实，陈吉棣. 山楂及山楂黄酮预防大鼠脂质代谢紊乱的分子机制研究［J］.营养学报，2000，22(2):131.
       ［7］  范英昌，陆一竹，马东明. 调肝导浊中药对血载脂蛋白含量及肝细胞膜脂蛋白受体的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2002，10(3):233.
       基金项目：湖北省武汉市科技攻关资助项目（No.20026007171）
       (江汉大学医学与生命科学学院 ，湖北 武汉  430056；湖北中医学院， 湖北 武汉  430061； 武汉市中医院 ，湖北 武汉  430014）