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       【关键词】  脑心通胶囊；,,大脑中动脉闭塞；,,血管性痴呆；,,学习记忆；,,海马
       摘要：目的观察脑心通胶囊对血管性痴呆模型大鼠行为学及海马组织形态学的作用。方法采用大脑中动脉闭塞法(MCAO)制作血管性痴呆动物模型; 跳台试验测定大鼠学习记忆成绩; 取脑组织作冰冻切片，HE染色，观察大鼠海马形态学改变。结果跳台实验中，与假手术组比较，模型组大鼠存在着明显的学习记忆障碍；与模型组比较，脑心通胶囊、喜得镇两治疗组大鼠学习记忆能力得到改善，且两组相比无显著性差异。光镜观察显示，假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紧密整齐，无明显神经元脱失；模型组大鼠海马CA1区锥体细胞排列稀疏、紊乱，神经元脱失明显，可见胶质细胞增生，中、西药治疗组可明显减轻大鼠CA1区海马神经元脱失现象，使锥体细胞形态较正常，排列较整齐，接近假手术组。结论脑心通胶囊对血管性痴呆模型大鼠有治疗作用。
       关键词：脑心通胶囊；  大脑中动脉闭塞；  血管性痴呆；  学习记忆；  海马
       Therapeutic Effects of Naoxintong Capsule on Rats Model of Vascular Dementia
       HE Mingda ,     LI Hong 
       （Department of Traditional Chinese Medicine, Second Xiangya Hospital,Central South University, Changsha 410011, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of Naoxintong capsule on behavior and hippocampal histomorphology in vascular dementia rats.MethodsThe vascular dementia model was established by occlusion of the middle cerebral artery in rats. The faculty of learning and memory were evaluated by stepdown avoidance test. The brain tissues were removed to be made frozen sections and stained with HE,and then the hippocampal histomorphology was observed and analyzed by light microcope. ResultsThe results of step-down avoidance test showed that compared with sham-operated group,model group presented significant learning and memory disorder; compared with model group, Naoxintong capsule group and Hydergine group exhibited improvement of learning and memory disability.Meanwhile,there existed no obvious difference between these two therapy groups. Under the light microscope, hippocampal CA1 field of rats in the sham-operated group exhibited closely and neatly spaced pyramidal cells, and insignificant neuron loss;in the hippocampal CA1 field of rats in the model group sparse and disturbed pyramidal cells ,noticeable neuron loss and neuroglial cell proliferation could be seen. Neuron loss reduced significantly in the hippocampal CA1 pyramidal cell field of the two therapy group and cell morphology presented relative normal.ConclusionNaoxintong capsule has therapeutic effect on rat model of vascular dementia.
       Key words：Naoxintong capsule;  Middle cerebral artery occlusion;  Vascular dementia;  Learning and memory;  Hippocampus 
   
　　血管性痴呆(Vascular Dementia, VD)是因脑血管疾病所致的智能及认知能障碍临床综合征。随着社会人口老龄化和脑卒中治疗存活率的提高，VD的发病率愈来愈高。脑心通胶囊临床治疗缺血性脑卒中效果肯定，亦有学者将其扩展应用于VD的治疗［1］，发现脑心通胶囊对VD的智能及其中医主症均有改善作用。本实验旨在通过观察脑心通胶囊对拟血管性痴呆模型大鼠行为学及脑组织形态学的影响，为其临床治疗VD提供实验依据。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物 健康清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体重200~250 g，由中南大学湘雅二医院动物实验室提供，合格证号：(湘)20040013。
       1.2  药物脑心通胶囊(药粉)为实验药物，1 g药粉相当于1g生药，由咸阳步长制药有限公司生产，实验时用双蒸水配成浓度为0.05 g/ml的混悬液。喜德镇为阳性对照药物，1mg/片，系天津华津制药厂与北  京诺华制药有限公司合作产品。将药片碾碎溶于双蒸水经超声细胞粉碎机制成浓度为0.062 5 mg/ml的混悬液。药物配制后置4℃水箱保存备用，用前摇匀。
       1.3  血管性痴呆大鼠模型的建立参照尹军祥等［2］的方法略加改进复制血管性痴呆大鼠模型。线栓采用直径为0.237 mm的尼龙鱼线，头端覆以指甲油，距头端2 cm处作标记，以10%水合氯醛(0.35 ml/100 g体重)腹腔注射麻醉大鼠后，将其腹卧位固定于手术板上，以络合碘消毒颈部皮肤。行颈部右侧切口，于胸骨舌骨肌与胸骨甲状肌间分离出右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎CCA近心端与ECA，用微动脉夹夹闭ICA远心端后，于CCA分叉处下端迅速作一切口，从切口处插入线栓。线插入ICA后，于入口处稍稍结扎尼龙线与入口出CCA段，然后松开夹闭ICA的动脉夹，继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤，至线插入深度为18～20 mm左右，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。再次结扎入口处，尼龙线外留约3 cm，缝合皮肤。2 h后轻轻提拉所留线头至有阻力，实现大脑中动脉再灌，则造模完成。假手术组只结扎ECA与ICA。
       1.4  动物分组及给药将40只大鼠完全随机分为4组(随机数字表法)：假手术组(10只)、模型组(10只) 、中药组(10只)和西药组(10只)。中药组给予脑心通灌胃0.5 g/（kg・d）-1,西药组给予喜德镇灌胃0.625 mg/（kg・d）-1假手术组和模型组给予等体积蒸馏水1 ml/100 g灌胃。术后第1天即用药，灌胃1次/d，连续给药28 d后，进行行为学测试，然后取脑测定相应指标。
       1.5  行为学测试 跳台实验跳台装置参照文献［3］自制为一25 cm×20 cm×75 cm大小的被动回避反应箱，箱底铺直径为1 mm铜栅，通360 V交流电，箱壁由黑色塑料板围成，铜栅的一角固定8 cm×8 cm×5 cm大小的塑料泡沫块作为动物回避电击反应的安全区。先将大鼠放入箱中自由活动3 min，熟悉环境，然后接通铜栅电源，大鼠受到电击，其正常反应是跳回泡沫块以躲避伤害性刺激，多数大鼠可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击(双足同时接触铜栅)又跳回安全区，如此训练5 min，并记录每只大鼠首次找到安全区所需的时间(反应时间)和5 min内受到的电击次数(错误次数)，作为学习测试成绩。24 h后重复上述试验，记录每只大鼠第一次跳下安全区的时间（潜伏期）和错误次数，作为记忆测试成绩。
       1.6  形态学观察各组随机取4只大鼠，麻醉方法同前，腹卧位固定于手术板上。打开胸腔，暴露心脏，将灌注穿刺针自心尖部穿入左心室至升主动脉根部。予生理盐水冲洗及4%多聚甲醛心脏灌注固定，取右侧脑组织置4℃固定液后固定约6~8 h。组织经蔗糖溶液脱水，于20℃在LEICA CM1800型恒冷箱切片机中冠状连续切片，片厚15 μm，取海马和齿状回互包平面，每隔6张取1张，行冰冻切片HE染色，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下观察海马形态学变化。
       1.7  统计学方法 计量资料数据以 ±s表示，应用SPSS11.0统计软件，组间比较应用单因素方分析，各实验组间的两两比较采用q检验，以P<0.05认为有统计学意义。方差齐性检验以a=0.10为检验水准。
       　　2  结果
       2.1  一般情况造模后，手术组大鼠早期出现明显的神经行为功能缺陷症状，表现为右侧肢体无力，瘫痪，向右侧转圈，倾倒，甚至不能行走。假手术组大鼠神经行为功能正常。随着时间延长，模型组大鼠表现为活动减少，皮毛不光泽，神经行为功能缺陷症状有所减轻；脑心通胶囊组和喜德镇组大鼠行动灵活，体重增加，皮毛润泽，神经行为功能缺陷症状明显减轻。
       2.2  跳台实验跳台实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠表现为反应时间延长，潜伏期缩短，错误次数增加，提示模型组大鼠存在着明显的学习记忆障碍；与模型组比较，脑心通胶囊和喜德镇两治疗组均能明显缩短大鼠反应时间，延长潜伏期，减少错误次数，改善VD大鼠学习记忆能力，且中西药组相比无显著性差异。结果见表1。
       表1  各组大鼠跳台实验的学习记忆成绩比较（略）
       与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01;  与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
       2.3  形态学观察光镜下假手术组大鼠海马锥体细胞排列整齐，紧密，层次丰富，形态正常，无变性，无胶质细胞增生，锥体细胞核大而圆，呈均匀淡蓝色或蓝色，核仁清晰，细胞质丰富(见图1)。模型组大鼠海马锥体细胞排列稀疏紊乱，细胞脱失明显，尤以CA1区显著，甚至仅见少量残存的不规则细胞；细胞核体积变小，深染，呈核固缩，或细胞核仅呈很淡的蓝色甚至蓝色消失(见图2)。中、西药两治疗组大鼠海马神经元脱失现象较轻，CA1区锥体细胞排列较模型组整齐，形态较正常，接近假手术组(见图3)。
       　　3  讨论
       血管性痴呆的发生与脑血管疾病密切相关。大脑中动脉区是人群脑卒中的多发部位，大脑中动脉闭塞(MCAO)模型是目前研究缺血性脑卒中的经典动物模型。尹军祥等［2］将其用于VD动物模型的研究，经水迷宫实验证实该模型动物存在明显的学习记忆障碍，是较理想的VD模型。同时因结扎了同侧颈总动脉，使得同侧海马及皮质处于慢性缺血状态，具有模拟因大脑低灌注损伤所致学习记忆能力下降的特点。痴呆主要表现为智能衰退，智能通常包括抽象思维能力、理解力、判断力、学习记忆、适应社会环境的能力等，其中学习记忆是智力的最基本要素，且易于测定分析，故目前常把学习记忆成绩作为评价智能的一个主要指标［4］。动物实验中，各种行为学检验装置从不同方面对学习记忆过程进行检验。八臂放射迷宫试验常用于评价空间学习能力和工作记忆，Morris水迷宫常用于检验空间学习能力和参考记忆，跳台试验作为一次性被动回避反应常用于评价外显记忆功能［5］。本研究中跳台试验成绩显示，模型组大鼠较假手术组大鼠在学习记忆测试中表现为反应时间延长(P<0.05)，潜伏期缩短(P<0.05)，错误次数增加(P<0.05)，存在着明显的学习记忆障碍，进一步证实了大脑中动脉闭塞模型作为VD动物模型的可靠性。
       a海马CA1区锥体细胞层次丰富，排列紧密(HE×100)
 
　　b细胞形态正常,核仁清晰,胞核大而圆,胞质丰富(HE×400)
       图1  假手术组大鼠海马组织HE染色（略）
       a海马CA1区锥体细胞脱失明显, 排列稀疏(HE×100)
 
　　b细胞形态不规则, 胞核体积变小、深染,或胞核蓝色消失(HE×400)
       图2  模型组大鼠海马组织HE染色（略）
       a海马CA1区锥体细胞层次较丰富，神经元脱失现象减轻(HE×100)
 
　　b细胞形态较正常，接近假手术组(HE×400)
       图3  脑心通胶囊组大鼠海马组织染色（略）
       中医并无血管性痴呆病名，多将其与老年性痴呆同归属于“老年呆病”范畴。血管性痴呆病因病机复杂，各家认识有所不同，但一般研究认为：本病病位在脑，涉及心肝脾肾，病性为本虚标实，虚有肾虚、气虚，实有风、火、痰、淤，二者互为因果，治疗时应标本兼治，以补虚不忘调气化痰活血，祛邪不忘益精养血补气为原则，脑心通胶囊由黄芪、丹参、当归、川芎、赤芍、红花、乳香、没药、全蝎、地龙、水蛭、血竭、三七、桂枝、葛根、牛膝16味中药组成，虚实并治，平衡阴阳，具有益气活血，化淤通络之功效。现代药理研究表明，黄芪对自然衰老大鼠大脑皮质、海马，纹状体部位的M胆碱受体数目有显著的上调作用，对改善记忆思维能力有一定效果［6］。丁基苯酞是当归的主要成分之一，对局灶性脑缺血后脑组织中及低糖、低氧、NMDA诱导的神经元损伤后ChAT皆具有明显的保护作用，而且可能是其直接作用的结果，这可能是丁基苯酞改善局灶性脑缺血后学习记忆功能的作用机制之一［7］。杨军等［8］研究发现，赤芍总甙对各种学习记忆障碍模型小鼠均有明显的改善作用，其作用可能与改善血液流变学, 增加脑血流量, 改善缺氧时能量代谢，调节相关代谢产物及改善神经纤维传导功能等作用有关。王红等［9］用跳台法观察了葛根和川芎水煎剂对小鼠学习记忆的影响，结果表明，葛根水煎剂对记忆过程的3个阶段：即记忆获得，记忆巩固和记忆再现均有改善作用，而川芎水煎剂对小鼠记忆巩固障碍无明显影响，说明川芎与葛根对学习记忆的影响具有不同机制。实验结果提示脑心通胶囊对VD模型大鼠有治疗作用，但对其改善学习记忆能力的机制值得进一步探讨。
       　　参考文献：
       ［1］  李  青. 步长脑心通治疗血管性痴呆31例［J］.时珍国医国药，2000，11(6):535.
       ［2］  尹军祥，田金洲， 黄启福，等. MCAO拟血管性痴呆大鼠模型的建立［J］.中国病理生理杂志， 2003，19(8):1144.
       ［3］  张均田. 现代药理实验方法［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：1020.
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       ［5］  Shim Insop，Ha Yoon，Chung Jin Young, et al．Association of learning and memory impairments with changes in the Septohippocampal Cholinergic System in Rats with Kaolin-induced Hydrocephalus［J］.Neurosur,2003,53(2):416.
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       ［7］  种兆忠，冯亦璞 . 丁基苯酞对缺血脑组织中及低糖低氧刺激后培养的神经细胞中胆碱乙酰化酶活性的影响［J］.中国药学杂志，1999，34(8):519.
       ［8］  杨  军，王  静，张继训，等.赤芍总甙对小鼠学习记忆能力的改善作用［J］.中国药理学通报，2000， 16(1):46.
       ［9］  王  红，许  哲， 刘干中. 葛根及川芎对动物学习记忆的影响［J］.中日友好医院学报， 1995，9(14):91.
       (中南大学湘雅二医院，湖南 长沙  410011)