文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【关键词】  人参皂苷Rb1；,,芳维甲酸乙酯；,,基质金属蛋白酶；,,成纤维细胞；,,免疫组织化学
       摘要：目的通过人参皂苷Rb1与芳维甲酸乙酯对皮肤真皮体外培养光老化成纤维细胞胞质内基质金属蛋白酶表达的影响，阐明人参皂苷Rb1对光老化的防治机理，探索光老化的防治手段。方法建立体外培养真皮成纤维细胞光老化模型，用人参皂苷Rb1与芳维甲酸乙酯进行干扰，免疫组织化学技术显示基质金属蛋白酶的表达的改变。结果人参皂苷Rb1与芳维甲酸乙酯对培养成纤维细胞胞质基质金属蛋白酶的表达有显著抑制作用（P<0.05）；人参皂苷Rb1和芳维甲酸乙酯对其表达的抑制作用相互之间差异无显著性(P>0.05)。结论人参皂苷Rb1对光老化成纤维细胞具有与芳维甲酸乙酯相似的防治作用，其机理与芳维甲酸乙酯的作用机理可能相同或者相似，及通过调节MMPs活性防治皮肤光老化。
       关键词：人参皂苷Rb1；  芳维甲酸乙酯；  基质金属蛋白酶；  成纤维细胞；  免疫组织化学
       Comparative Study of the Effect of the Ginsenoside Rb1 and Arotinoid Ethyl  Ester on the Expression of  MMPs in Sun-induced Aging Dermis Fibroblasts
       CHENG Jiyan， LIU Guohong, HUANG Jichun, YU Hong, LIU Guangyi
       （Department of Histology and Embryology, Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan 646000, China； Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan  450052, China）
       Abstract：ObjectiveTo explore  the  methods  of  prevention  and  cure  of  sun-induced  aging  dermis, and clarify the mechanism of Ginsenoside Rb1 on sun-induced  aging  dermis, with the study of expression of matrix metallo preteinases in sun-induced  aging dermis fibroblasts"  cytoplast, which are cultured in vitro, under the effect of Ginsenoside Rb1 and arotinoid ethyl ester. MethodsBuild the dermis fibroblasts sun-induced aging model, and affect the cells with Ginsenoside Rb1 and  arotinoid ethyl ester, and display the change of expression of matrix metallo preteinases with  immunohistochemistry. ResultsGinsenoside Rb1 and arotinoid  ethyl  ester  had significant inhibition effect on  the  expression  of  matrix  metallo preteinases in the fibroblasts" cytoplast cultured  in vitro（P<0.05）; the inhibition roles of  Ginsenoside Rb1 and arotinoid ethyl ester on the expression of matrix metallo preteinases were not significant(P>0.05). ConclusionGinsenoside Rb1 has effect of prevention and cure of sun-induced aging dermis"s fibroblasts like the arotinoid  ethyl  ester, and  its  mechanism is the same as or like the arotinoid ethyl ester through regulating the expression of matrix  metallo preteinases.
       Key words：Ginsenoside Rb1;  Arotinoid ethyl ester;  Matrix metallo preteinases;  Fibroblast;  Immunohistochemistry
   
　　皮肤老化是人体衰老的主要表现之一，也是目前人们极为关注的话题。长期反复的紫外线照射是皮肤光老化的重要因素，皱纹形成是皮肤光老化的最为重要特征。研究皱纹形成机理对防治紫外线辐射损伤及皮肤老化有重要意义。维甲酸对光老化皮肤的治疗作用已经被大量的研究所证实，并且已经应用于临床，但有研究表明维甲酸虽然已经经历了几代，仍然有许多很难克服的毒副作用［1~3］。人参具有保护机体细胞和全身免受应激的影响，降低血糖和血胆固醇，促进新陈代谢等功能，目前已经广泛应用于临床的许多方面，包括在很多皮肤保健品和化妆品内［4，5］。本研究通过用人参的有效成分之一―人参皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）与芳维甲酸乙酯（arotinoid  ethyl ester）的对比研究，目的在于阐明人参皂苷Rb1防治光老化的可能机理，探索更为有效的皮肤光老化的防治方法。基质金属蛋白酶(matrix metallo preteinases,MMPs)在各种生理、病理条件下细胞外基质降解和重塑中起着关键作用，可以降解含或不含胶原成分的皮肤真皮细胞外基质。有研究表明，在在体实验和细胞培养实验中， MMPs在衰老皮肤真皮成纤维细胞（fibroblast；FB）的表达明显增强，说明其在衰老发生及皱纹形成过程中有重要作用，尤其是MMP1和MMP3［6，7］。在本研究中选择MMP1和MMP3作为光老化皮肤真皮的老化程度指标进行研究。
       　　1   材料与方法
       1.1  取材健康新生儿包皮真皮。
       1.2  主要仪器设备与试剂芳维甲酸乙酯（购于市场），溶于吐温20 (山西省天星生化药业有限公司)；人参皂苷Rb1（中国医科大学化学教研室），溶于二甲基亚砜；MMP1和MMP3免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；8甲氧补骨脂素(8MOP)；四唑盐(MTT)试剂；等。紫外线功率测定仪（上海西格玛高技术公司）；二氧化碳培养箱；长波紫外线（UVA）灯管；等。
       1.3  细胞培养及分组处理细胞培养、细胞复苏、细胞传代等实验方法，细胞接受紫外线照射、8MOP、芳维甲酸乙酯、人参皂苷Rb1等药物处理等实验方法，确定无毒性紫外线照射剂量、8MOP、芳维甲酸乙酯、人参皂苷Rb1等药物的最佳作用浓度、选择作用时间等实验方法，完全参照文献［8］进行。具体分组及各组处理方法：正常对照组（control group；CG）；阳性对照组（masculine  group；MG）：UVA+8MOP；维甲酸实验组（arotinoid ethyl ester treatment group；AG）：UVA+8MOP+芳维甲酸乙酯；人参皂苷Rb1实验组（Ginsenoside Rb1  treatment  group；GG）：UVA+8MOP+人参皂苷Rb1。人参皂苷Rb1剂量为20，50，100 μg/ml（分别为GG1，GG2，GG3三组），作用时间为48 h。
       1.4  免疫组织化学实验SABC法显示各组MMP1和MMP3。步骤：中性甲醛固定培养细胞20 min→Triton-100打孔→3%双氧水灭活内源性酶7 min，蒸馏水洗→抗原修复液修复抗原，水洗→滴加正常山羊血清→滴加一抗（1∶200）孵育，pH7.3、0.01M PBS洗→滴加二抗（1∶100）孵育，PBS洗→DAB避光显色，镜下控制显色时间→蒸馏水终止显色，充分洗脱→脱水，封片［8］。
       1.5  结果观察与图像分析用光学显微镜对各组切片进行形态学观察，并采用盲法用IS4400图像分析仪，在400倍下进行图像分析。检测：(1)光密度（反映染色深浅）；(2)阳性反应区域与阴性反应区域比值(PNarea；PNarea与反应的强度无关，代表阳性着色颗粒的相对面积，可以反映阳性率)。均用±s表示。
       1.6  统计学分析对以上结果用SPSS10.0  For  Windows方差分析进行统计学检验，再用SNK q法进行组间比较。
       　　2  结果
       在光学显微镜下观察HE染色后的各组细胞，细胞密度没有明显的差异，细胞直径约20～35 μm。细胞形态呈星形，有3~7个突起，细胞核位于细胞的中央，体积较大。在HE染色条件下，细胞胞质呈弱嗜碱性。细胞周围可以看到少量纤维。在8MOP与紫外线作用后2 h后，培养成纤维细胞逐渐出现细胞老化的形态学改变，表现为细胞体积实质性增大，胞质内出现一些颗粒，细胞核体积略为减小，染色逐渐加深。在免疫组织化学染色切片中，可以看到各组成纤维细胞内部MMP1和MMP3阳性产物，分布在细胞胞质内，呈棕黄色颗粒。其表达48 h最强，然后逐渐减弱，72 h逐渐恢复。免疫组织化学染色图像分析光密度和胶厚面积结果（表1）所示，阳性对照组MMP1和MMP3表达明显增强，与对照组之间差异有显著性（P<0.05）；维甲酸组、人参皂苷各组与阳性对照组比较，差异有显著性，表达明显减弱（P<0.05）；维甲酸组、人参皂苷各组之间比较，差异无显著性(P>0.05)。
       表1  48 h各组成纤维细胞MMP1和MMP3免疫组织化学染色光密度（略）
       与MG比较， *P<0.05；AG、GG1、GG2、GG3各组组间比较，P>0.05；n=24
       　　3  讨论
       有研究表明［7］，在8MOP与UVA的共同作用下，可迅速诱导体外培养真皮成纤维细胞衰老，为研究皮肤光老化提供了很好的体外培养细胞老化的实验模型。在该实验的研究结果显示，8MOP与UVA共同作用条件下，培养真皮成纤维细胞2 h后，培养成纤维细胞逐渐出现细胞老化的形态学改变，表现为细胞体积实质性增大，胞质内出现一些颗粒，细胞核体积略为减小，染色逐渐加深。维甲酸对皮肤光老化的防治作用已被大量的研究所证实［1~3］。虽然维甲酸的发展和应用已经经历了几代，但维甲酸见光易分解、对皮肤刺激性强、起效较慢、具有导致畸形等等缺点使其应用受到了很大的限制。芳维甲酸乙酯为第三代维甲酸的重要代表，具有低有效剂量、副作用相对较少的特性，在临床上已经广泛用于皮肤光老化的防治。该研究以芳维甲酸乙酯作为对照进行研究，探索中药人参提纯品人参皂苷Rb1对皮肤真皮成纤维细胞老化的防治作用，有坚实的实验基础和理论依据。在正常生理情况下，结缔组织产生的MMPs参与组织发育中的重构和组织损伤后的部分修复过程，避免间质水解引起组织过度损伤。有研究表明，在皮肤真皮的成纤维细胞胞质内，皮肤的损伤过程中有明显的MMPs的表达，尤其是MMP1和MMP3。在该研究的中，经紫外线照射和8甲氧补骨脂素作用后，培养成纤维细胞胞质内的MMP1和MMP3的表达明显增强，也证实其它研究者的实验结果［6，7］。成纤维细胞胞质内出现了明显的MMP1、MMP3的表达，以照射后48h最强，随后逐渐减弱，72 h逐渐恢复。这和Fisher等［9］报道的自然条件下日光照射引起的改变相一致。这表明MMPs的表达增强可能是长波紫外线辐射损伤的重要机制，也提示通过研究MMPs失衡的机制并进行调控，可能为防治皮肤光老化提供新的思路。作为传统名贵中药的人参应用于临床已有两千多年的历史。其内主要含有皂苷类。人参皂苷主要有Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf等单体，大约有18种。除单体皂苷外还含有蛋白质、酶类、多肽、氨基酸、人参多糖等。现代医学证明人参皂苷具有抗肿瘤、调节免疫功能增强人体表面细胞的活力、抑制衰老等作用。中医临床上应用人参治疗很多疾病，都有显著的疗效，但是其作用机制尚不完全清楚。国内对人参单体和化合物进行了一些基础性研究，特别是近几年有关人参皂苷的研究报道日益增多［4，5］。在该实验中，结果表明人参皂苷Rb1对体外培养的真皮成纤维细胞胞质内MMP1、MMP3的表达的调节作用与芳维甲酸乙酯的相似，提示人参皂苷Rb1对皮肤老化可能具有与维甲酸相似的预防和治疗作用，并且其作用机制与芳维甲酸乙酯的作用机制可能相同或者相似，与成纤维细胞胞质内的MMP1、MMP3有密切关系。但人参皂苷要全面应用于临床皮肤光老化的防治，还需要进行大量的实验研究，本实验仅仅为此方面的研究提供一个新的思路和实验基础。
       　　参考文献：
       ［1］  刘仲荣，张国威，何云志，等．芳维A酸乙酯对银屑病皮损角质形成细胞凋亡和bax表达的影响［J］.重庆医学，2001，30（2）：118.
       ［2］  李泽桂，蔡文琴，陈活彝．神经管发生与编程性细胞死亡［J］.解剖科学进展，1999，5（3）：222.
       ［3］  魏  骏.维甲酸外用治疗研究进展［J］.中国皮肤性病学杂志，1995，9（4）：233.
       ［4］  朱建明．人参皂苷的抗衰老研究进展［J］.中医药信息，1998；2：18．
       ［5］  寻晓红．人参皂苷的研究进展［J］.中国现代医学杂志，2003；13(15)：43．
       ［6］  Shworth JL, Murphy G, Rock MJ, et al．Fibrillin degradation by matrix metalloproteinases: implications for  connective tissue remodelling．Bio-chem  J,1999,340(Pt1):171.
       ［7］  Hermann G, Brermeisen P, Wlaschek M, et al．Paoralen photoactivation promotes morphological and functional  changes in fibroblasts in vitro reminiscent of  cellular senescence［J］． J Cell Sci, 1998,111(Pt 6):759.
       ［8］  程基焱，黄吉春，钟桂书，等．不同浓度雷公藤甲素对光老化皮肤成纤维细胞基质金属蛋白酶的影响：以维甲酸为标准对照［J］.中国临床康复，2005，9（22）：158.
       ［9］  Fisher GJ, Datta SC, Talwar HS, et al． Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid  antagoniam［J］．Nature, 1996,397:335.
       (泸州医学院，四川  泸州  646000；  郑州大学基础医学院，河南  郑州  450052)