文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究蟾酥对CEM细胞的抑制作用及其机制。方法应用MTT比色试验观察蟾酥对CEM细胞的抑制作用；采用光镜、电镜技术观察细胞形态结构的改变；利用流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率。结果①蟾酥能明显抑制CEM细胞的生长，药物浓度在0.032 μg/ml即具有显著的抑制作用，抑制率呈剂量和时间依赖性，半数抑制浓度（IC50）约为0.16 μg/ml，当药物浓度为4 μg/ml，作用72 h后，其抑制率达85.50%；②细胞形态学改变，细胞体积缩小，细胞膜皱缩，染色质明显浓缩，核聚集，边聚于核膜下呈新月形等典型的凋亡特征；③流式细胞术证实蟾酥能诱导CEM细胞凋亡，凋亡率也呈剂量和时间依赖性。结论 蟾酥对白血病CEM细胞的生长具有极强的抑制作用，诱导细胞凋亡是其机制之一。
       【关键词】  蟾酥 白血病 CEM细胞 凋亡
       
       Research on the Mechanisms of Inhibiting and Inducing Apoptosis Effects of Chansu on CEM Cells
       ZHU Dacheng，YIN Xiaoming，HUANG Xueming， CHEN Xiuzhen, WU Qinghua, XIAO Chun
       1.Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China;
       2.Jiangxi Provincial People’s Hospital,Nanchang 330006,China;
       3.The First Affliated Hospital of Nanchang University ,Nanchang 330006,China;4.Jiangxi Provincial Cancer Hospital,Nanchang 330029,China
       Abstract:ObjectiveThe aim is to research the inhibiting function and the mechanism of Chansu to the CEM cells. MethodsApplied MTT assay to observe the inhibiting function to CEM cells; using microscope and electron microscope to observe the change of cell structure; using FCM to detect apoptosis rates.Results①Chansu inhibited the growth of CEM cells obviously as the medicine concentration to 0.032μg/ml or higher. Chansu induced apoptosis of CEM in dose and time-dependent manner. The IC50 value of Chansu for CEM cells was about 0.16μg/ml. And when the medicine took effects after 72 hours as a 4μg/ml concentration, the inhibiting rate was 85.5%. ②The cell appearance changed. It had the typical characteristic of apoptosis. The cell shrinked. Cell membrane crimpled. Chromatin concentrated evidently. Nucleus conglomerated to crescent under the karyotheca. ③FCM proved that Chansu induced the apoptosis of CEM cells. The apoptosis rate was also in dose and time-dependent manner.ConclusionChansu can inhibit the growth of CEM cell strongly. To induce apoptosis is one of its mechanisms.
       Key words:Chansu；   Leukemia；  CEM cell；  Apoptosis
        蟾酥（Chansu）为蟾蜍科中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥制成，性味甘辛、温、有毒，其有效成分多而复杂［1］。已有研究证实蟾酥及其有效成分能诱导髓系白血病HL-60，K562，U937，ML1等细胞凋亡［2］，曾有报道蟾蜍治愈淋巴细胞白血病［3］。我们以蟾酥作用人T淋巴细胞白血病CEM细胞株，研究蟾酥抑制CEM细胞株的机制，现报道如下。
       1  材料和方法
       1.1  药品
        
       蟾酥购于山东临沂爱康药业有限公司，将蟾酥块置于研钵内研磨，用三蒸水溶解、过滤成乳白色，再用无水乙醇让蟾酥充分溶解后，呈无色，再过滤蒸发成粉末，然后精密称重，用三蒸水稀释，并加吐温-80让蟾酥粉末充分溶解，配成含7%吐温-80的蟾酥溶液，浓度为10 mg/ml，滤过除菌备用。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜 （DMSO）为Sigma公司产品。
       1.2  细胞培养 
       CEM细胞购于中国医学科学院血液学研究所（天津）。培养基为含体积分数为10%的胎牛血清（FCS）的RPMI（Gibco公司产品），并加入双抗（青霉素100 u/ml和链霉素100 μg/ml）。在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱（Therno Forma公司产品）中培养。取对数生长期细胞进行实验。
       1.3  MTT比色试验 
       将CEM细胞悬液离心（1 500 r/min，8 min），台盼蓝拒染法进行细胞计数，调整细胞终浓度为3×105/ml进行实验，将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔190 μl，24 h后，实验组分别加入5种不同浓度的蟾酥溶液（终浓度分别为0.006 4，0.032，0.16，0.8，4 μg/ml）10 μl，对照组不加药，微型震荡，另设空白组（只有培养基，无细胞）每组5个复孔，培养于3个时间段（24，48，72 h）后，每孔加MTT（5 mg/ml）20 μl，继续培养4 h后，离心（1 500 r/min，8 min），弃上清液，每孔加DMSO 150 μl，避光微振荡，让甲臜溶解充分，置于自动酶标仪，测492 nm处的吸光度（A492）值。抑制率（%）=［（对照组A值-实验组A值）/对照组A值］×100%。
       1.4  形态学观察 
       蟾酥作用于CEM细胞时间和浓度同MTT比色实验，倒置显微镜下观察实验组和对照组CEM细胞的一般情况；CEM细胞悬液离心涂片，Giemsa染色，油镜下观察细胞形态；取蟾酥三个浓度（0.006 4，0.032，0.16 μg/ml）作用于CEM细胞，两个时间段（24，48 h）后，制成超薄切片，在透视电镜下观察细胞超微结构及凋亡小体。
       1.5  流式细胞术（FCM）分析 
       蟾酥3个浓度（0.006 4，0.032，0.16 μg/ml），作用于CEM细胞两个时间段（24，48 h）后，细胞用PBS洗两遍，70%乙醇固定，重悬于PBS中调整细胞浓度为1×106/ml，取100 μl，加碘化吡啶（PI） 1 ml，轻轻混匀置4℃，30 min，上机检测（流式仪为 BECTON DTCKINSON，B.D公司产品），采用CenQuest软件上机获取10 000个细胞，ModFitlt软件分析并统计结果。
       1.6  统计学分析 
       采用双侧t检验 ，求P值，P＜0.05，差异有显著性。
       2  结果
       2.1  蟾酥对白血病CEM细胞生长的影响 
       不同时间和剂量，蟾酥对CEM细胞作用见表1 ，0.032 μg/ml的蟾酥即可显著抑制CEM细胞生长，半数抑制浓度（IC50）约为0.16 μg/ml，从表1可见，蟾酥对CEM细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性。表1  蟾酥CEM细胞生长的影响（略）
       2.2  细胞形态学变化
       2.2.1 光镜
        
       倒置显微镜下可见，对照组（图1）细胞多且饱满，大小均一、有侧凸；实验组（图2）细胞数量有所减少，细胞皱缩，体积变小，且高剂量组大部分细胞已破碎（图3），有坏死趋向。涂片，Giemsa染色，油镜下可见，对照组（图4）CEM细胞着色深，大小基本一致，球形，核大，核浆比例失调。实验组（图5）CEM细胞体积明显缩小，大小不等，核浓染，核浆比例失调，胞膜皱缩，有些细胞的染色质凝集成块状，具备细胞凋亡的一些特征。
       2.2.2 电镜 
       可见对照组（图6）CEM细胞圆，常染色质丰富，核大呈肾形，核仁大且清楚，胞浆内线粒体、溶酶体和内质网丰富，细胞膜有微绒毛和伪足样突起。而蟾酥处理组低浓度（图7）时细胞体积缩小，核染色质凝聚，出现核碎片等早期细胞凋亡现象；有的细胞核膜已消失,许多凋亡小体融合成一个大的团块,胞浆内可见内质网等细胞器，细胞膜完整（图8）。随药物浓度增加，作用时间延长，凋亡细胞越多，凋亡特征越明显，并可见典型的新月形核的凋亡细胞（图9），细胞器变性， 细胞膜变光滑，体积缩小。有许多凋亡细胞产生膜完整的凋亡小体（图10）。
       2.3  流式细胞仪测定CEM细胞凋亡率的情况 
       蟾酥诱导CEM细胞凋亡率存在时间和药物浓度依赖性，随药物浓度的增加和时间的延长，凋亡率也增加（表2 ）。表2  蟾酥诱导CEM细胞调亡率（略）
       3  讨论
        实验结果显示：蟾酥处理CEM细胞后，能显著抑制其生长。抑制率具有时间和剂量依赖性，随着作用时间的延长，药物剂量的增大，抑制率逐步提高，当蟾酥浓度为4 μg/ml，作用72 h后，抑制率高达85.50%。光镜显示：细胞体积缩小，核浓染，细胞数量与对照组比较大为减少。电镜证明：形态学呈现典型的凋亡特征性改变，核染色质凝集，沿核膜周边聚集呈新月形，胞膜内陷包裹变性的细胞内容物成凋亡小体，这些变化是确认细胞凋亡的十分可靠的方法［4］。流式细胞术进一步说明蟾酥能诱导CEM细胞凋亡。
        细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。已知的相关基因多达数十种，细胞凋亡信号的传导具有多种途径，其过程受多种基因精确、严密的调控［5］。
        蟾酥作用于白血病细胞后，能下调凋亡相关基因c-myc，bcl-2的mRNA表达水平，上调bax mRNA表达水平，引起细胞凋亡［6］。蟾蜍灵通过抑制bcl-2蛋白上游的Na+-K+-ATP酶导致肿瘤细胞内Na+浓度改变，下调bcl-2的表达，选择性的诱导白血病细胞凋亡［7］。通过实验证明蟾酥具有抗人T淋巴细胞白血病CEM细胞的作用，诱导CEM细胞凋亡是它的机制。但其分子生物学机制是下调白血病细胞c-myc，bcl-2的mRNA的表达，还是上调bax mRNA的表达水平，抑制Na+-K+-ATP酶的活性或其他相关基因的表达，还有待进一步的研究。
       【参考文献】
         　　［1］程国华．蟾酥质量研究及其药理临床应用进展［J］.中草药，2001，32（2）：184．
       
       ［2］朱大诚，尹小明．蟾酥诱导白血病细胞凋亡的研究进展［J］.实用癌症杂志，2004，19（4）：447.
       
       ［3］尹小明，朱大诚．蟾蜍治疗白血病成活31年1例［J］.实用中西医结合临床，2005，5（1）：41．
       
       ［4］Thompson C B．Apoptosis in the Pathogenesis and Treatment of Disase［J］.Science，1995，267：1456.
       
       ［5］徐瑞成，陈小义，陈 莉，等 ．蟾蜍灵诱导人白血病HL-60细胞凋亡的初步研究［J］.中国中药杂志，2001，26（1）：59
       
       ［6］戴锡孟，徐 芳，郭 义．六神丸诱导白血病细胞凋亡及调控凋亡相关基因的实验研究［J］.辽宁中医杂志，2003，30（6）：431．
       
       ［7］Kawazoe N, Aiuchi T, Masuda Y, et al. Induction of apoptosis by bufalin in human tumor cells is associated with a change of intracellular concentration of Na+ ions［J］.J Biochem（Tokyo）, 1999，126(2):278．