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       【摘要】 
       目的筛选土茯苓多糖提取的最优化工艺。方法应用微波辅助提取技术，通过单因素和正交实验，以土茯苓多糖提取率为指标，筛选土茯苓多糖的最佳提取工艺条件。结果土茯苓多糖最佳提取工艺条件为：微波功率800W，固液比（g/ml）1∶30,提取温度100℃，回流浸提两次，10 min/次，浓缩液加90％乙醇醇析。结论优化后的工艺稳定，微波辅助提取土茯苓多糖，提取时间短、提取率高，另有较大部分土茯苓总黄酮也同时被浸出。按照优化后工艺条件实验，土茯苓多糖提取率、粗多糖得率以及粗多糖中多糖含量分别为8.33％，3.97％和39.5％。
       【关键词】  微波辅助提取 土茯苓 多糖 总黄酮
       Abstract:ObjectiveTo optimize the process of extracting polysaccharides from Smilax glabra Roxb. MethodsWith the extraction rate of polysaccharides as an examinable target, the optimal extraction conditions of polysaccharides has been proposed by microwave-assisted method through single factor experiment and orthogonal test method. ResultsThe optimal technological parameters of extracting polysaccharides were as follows: the microwave power, the solid-liquid ratio, the extract temperature and extract time were 800 W, 1∶30（g/ml）, 100℃ and 10min twice, respectively. Lastly, the crude polysaccharides were obtained by adding ethyl alcohol into the treated leachate after laying a period.ConclusionThe proposed method is stable and reliable for the extraction of polysaccharides from Smilax glabra Roxb., which has the advantages of short extraction time, high extraction rate and obtaining general flavonoids simultaneously with polysaccharides. Under the optimized operation conditions, the extraction ratio, extraction yield of crude polysaccharides and the content of polysaccharides in the crude polysaccharides were 8.33%, 3.97% and 39.5%, respectively.
       Key words:Microwave-assisted extraction；  Smilax glabra Roxb.；  Polysaccharides；  General flavonoids
        土茯苓为百合植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根，又名红土苓，其味甘、淡、平，归肝、胃经，具有除湿，解毒，通利关节作用，用于湿热淋浊、带下病、痈肿、瘰疬、疥癣、梅毒及汞中毒所致肢体拘挛,筋骨疼痛，为常用中药材［1］。土茯苓主要化学成分为黄酮、皂苷等，实验中发现较多的多糖类成分也存在于土茯苓中。鉴于多糖具有增强机体免疫力及抗癌等多方面生理活性，本实验对土茯苓中多糖的提取工艺进行了研究。
        微波辅助提取技术是近年来发展起来的一种新方法，具有选择性好、快速、高效、安全、节能等优点。本文首次报道了微波辅助提取技术在土茯苓多糖提取中的应用，通过单因素和正交实验，采用水提醇沉法研究土茯苓多糖的优化提取工艺，以期对土茯苓药材的应用提供基本资料。
       1  材料与方法
       1.1  原料及试剂
       土茯苓饮片购于三九中药房，经湖北中药研究院王克勤研究员鉴定为百合植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.；葡萄糖、芦丁（Rutin）购于中国药品生物制品检定所；其他试剂均为国产分析纯。
       1.2  仪器XH-100A型祥鹄电脑微波催化／合成萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；UV-7504紫外可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司）； TDL-5-A台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；旋转蒸发仪RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。
       1.3  原理微波加热是利用微波场中介质的偶极子转向极化和界面极化的时间与微波频率相吻合的特点，促使介质转动能级跃迁，加剧热运动，将电能转化为热能。从细胞破碎的微观角度看，微波加热导致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热量，使胞内温度迅速上升，水气化产生压力使细胞膜（壁）破裂，产生微孔或裂纹，从而使细胞内物质更容易被溶剂溶出，达到萃取目的［2，3］。
       1.4  分析方法采用苯酚-硫酸法［4］测定土茯苓多糖的含量；总黄酮含量测定方法参照文献［5］。
       1.4.1  对照品溶液的配制精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.514 g，置于小烧杯中，加去离子水溶解，移入500 ml容量瓶中，以去离子水定容至刻度，摇匀，配成1.003 mg/ml的标准溶液。然后精密吸取葡萄糖标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml分别置于50 ml容量瓶中，加去离子水定容，摇匀，得系列对照品溶液。
       1.4.2  苯酚试剂的配制苯酚储备液的制备：取苯酚200 g，加锌粉0.2 g和碳酸氢钠0.1 g，蒸馏收集182℃馏分，称取此馏分60.0 g，加40.0 g水使其溶解，为60.0％苯酚储备液，置冰箱中避光储存备用。
       1.4.3  标准曲线的绘制准确吸取上述系列对照品溶液各2.0 ml，分别于具塞试管中，各加入6.0％苯酚试剂1.0 ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5 ml，待试管冷却后，沸水浴中煮15 min，取出冷却至室温，于波长490 nm处测定其吸光度。同时精密吸取去离子水2.0 ml，同法操作，作空白对照。以葡萄糖浓度（C）对吸光度（A）作回归处理，得回归方程：C=0.006 57+0.069 69A(r=0.998 9)，葡萄糖在20.06～140.40 μg/ml之间线性关系良好。
       1.5  方法
       1.5.1  土茯苓多糖的提取与精制［6］
       称取干燥至恒重的土茯苓饮片100 g，先经石油醚(60～90℃)回流脱脂提取，抽滤。药渣经真空干燥后再用80%乙醇回流提取，除去单糖和低聚糖，抽滤。药渣经真空干燥后，加蒸馏水回流，提取多次。合并水提取液，减压浓缩，用Sevage法（氯仿-正丁醇多次萃取）除去浓缩液中蛋白。离心，水层加适量活性炭60℃保温脱色，离心，上清液加入一定量乙醇，于冰箱静置过夜，抽滤，滤渣先后用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，经真空干燥，得土茯苓多糖。将土茯苓多糖溶于适量的水，经过二次醇沉操作后可得精制土茯苓多糖。
       1.5.2  换算因子的测定［7］
       精密称取干燥至恒重的精制土茯苓多糖3 mg，置于10 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得精制多糖样品溶液，浓度为300 μg／ml。分别取0.4，0.6，0.8，1.0 ml和1.2 ml，补水至2.0 ml，按“1.4”项所述方法测定吸光度，由回归方程计算出供试液中葡萄糖含量，按下式计算换算因子。测得换算因子f=1.85。
        换算因子f =m/cD
        式中，m 为称取多糖的质量(μg)，c为多糖液中葡萄糖的含量(μg／ml)，D 为多糖的稀释倍数。
       1.5.3  供试品的制备与测定精密吸取样品提取液，稀释定容后，按照“1.4.3”项标准曲线的绘制方法和文献［5］下操作，测定吸光度A值，按（a）式计算多糖和总黄酮提取率。精密称取沉淀出的土茯苓多糖，加适量蒸馏水超声使溶解，定容，按照“1.4.3”项标准曲线的绘制方法下操作测定吸光度A值，按（b）式计算多糖含量。乙醇沉淀出来多糖得率按（c）式计算。
        （a）多糖（总黄酮）提取率＝c1V/m×100%
        （b）多糖含量＝c2Df /w×100%
        （c）粗多糖得率＝m1 /m×100%
        式中c1为提取液中葡萄糖(芦丁)质量浓度，c2为多糖溶液中葡萄糖质量浓度，V为多糖（总黄酮）提取液体积，D为多糖溶液的稀释倍数，f为测得的换算因子，m1为沉淀出来土茯苓多糖质量，m为干燥土茯苓样品质量，w为土茯苓多糖样品质量。
       2  方法与结果
       2.1  微波辅助提取土茯苓多糖的单因素实验
       2.1.1  提取时间对土茯苓多糖提取率的影响称取经过预处理（分别用石油醚、80％乙醇各提取两次，第1次20倍体积2 h，第2次10倍体积1 h，下同）的干燥土茯苓饮片5 g（干燥饮片浸泡20 min后，微波提取两次，下同），固定固液比（g/ml，下同）为1∶30，微波功率为800W，微波提取温度为100℃，考查微波提取时间对土茯苓多糖和总黄酮提取率的影响，设计时间分别为4，6，8，10，12 min和14 min。结果见图1。
        从图1可看出，提取时间在4～14 min内，多糖和总黄酮提取率变化趋势基本相同。随时间增加，土茯苓多糖和总黄酮提取率先增加，10 min后含量略有减小。这可能是由于提取时间增加，微波辐射时间也相应增加，对细胞膜（壁）的破碎作用就比较大，溶出物多，多糖和总黄酮提取量也就高。时间增加到一定程度后，多糖和总黄酮浸出量增加较少，但样品中黏液质等杂质进入浸出液，使得浸出液黏度增大，从而扩散速度变慢，过滤也变得困难，这样，就会造成较多的多糖和总黄酮含于滤渣中而被损失，减少了提取液中多糖和总黄酮含量。因此，提取时间宜选取在10 min左右。
       2.1.2  微波提取温度对土茯苓多糖提取率的影响称取经过预处理的干燥土茯苓饮片5 g，固定固液比为1∶30，微波功率为800 W，提取时间为10 min，考查微波提取温度对土茯苓多糖和总黄酮提取率的影响，设计温度分别为60，70，80，90，100℃和110℃。结果见图2。
        由图2可以看出，温度在60～110℃范围内，多糖和总黄酮提取率变化趋势基本相同，但总黄酮提取率变化相对范围大于多糖。在60～100℃范围内，土茯苓多糖和总黄酮提取率随温度上升而明显提高，这一方面是因为在微波功率一定的前提下，提取的温度越高，要达到提取温度所需的微波辐射时间就越长，从而有利于细胞内物质的浸出；另一方面可能是由于提取液温度升高，分子运动加剧，有利于细胞内糖和总黄酮的溶解浸出。超过100℃时，剧烈沸腾会导致部分提取液溅出，多糖和总黄酮因而损失掉，故多糖和总黄酮提取率有所下降。所以微波提取温度在100℃左右为宜。
       2.1.3  微波功率对土茯苓多糖提取率的影响称取经过预处理的干燥土茯苓饮片5g，固定固液比为1∶30，提取时间为10 min，微波提取温度为100℃，考查微波功率对土茯苓多糖和总黄酮提取率的影响，设计功率分别为500，600，700，800，900 W和1 000 W。结果见图3。
        由图3知, 微波功率在500～1 000W范围内，土茯苓多糖提取率先增大后略微减小。这是因为微波在功率低时对细胞膜（壁）的破坏作用较小，细胞内溶出物也较少，多糖浸出率就低；随着微波功率不断增大，分子运动加剧，细胞内水蒸气汽化产生的压力使细胞膜（壁）破坏程度加大，细胞内多糖的浸出率也随之提高。但细胞膜（壁）并不会被无限制破碎，当微波功率过高时，微波对细胞内物质选择性加热的差异减小，反而使多糖分解，造成多糖提取率降低。而在此范围内，土茯苓总黄酮提取率变化很大，迅速增大后，当微波功率超过700 W时又迅速减小，这说明土茯苓总黄酮的浸出对微波加热功率的选择性优于多糖。
       2.1.4  固液比对土茯苓多糖提取率的影响称取经过预处理的干燥土茯苓饮片5 g，固定提取时间为10 min，微波提取温度为100℃，微波功率为800 W，考查固液比对土茯苓多糖和总黄酮提取率的影响，设计固液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50。结果见图4。
        由图4知,固液比在1∶10～1∶50范围内，土茯苓多糖和总黄酮提取率随固液比的增大而增大。这是因为加水量越大提取出来的多糖和总黄酮越易溶解。但当固液比达到1∶30后，多糖和总黄酮的提取率基本保持不变，所以固液比应控制在1∶30左右较宜。
       2.2  微波辅助提取工艺的正交实验在单因素实验的基础上进行正交设计实验，优化提取工艺。称取经过预处理（同2.1）的干燥土茯苓饮片5 g，共9组，浸泡20 min，按照正交设计分别进行微波辅助提取（两次），并计算土茯苓多糖提取率。正交设计见表1，正交实验及结果见表2，方差分析见表3。表1  提取工艺因素水平（略）表2  L9(34)提取工艺正交实验结果（略）表3  方差分析结果（略）
        正交实验的方差分析结果显示：在本实验范围内，以土茯苓多糖提取率为评价指标，结合级差分析，各因素对提取效果的影响程度依次为B（提取温度）＞A（提取时间）＞C（微波功率）＞D（固液比），B因素影响差异有高度显著性，A因素影响差异有显著性。直观分析表明多糖提取率最高的工艺为A2B3C2D2，即药品在1∶30的固液比、800W的微波功率下，于100℃提取两次，10 min/次。
       2.3  乙醇沉淀实验取20g经过预处理的干燥土茯苓饮片，在最佳的提取工艺（提取时间10 min，提取温度100℃，微波功率800W，固液比1∶30）条件下提取两次，浓缩提取液至原体积的1/5～1/6，经过Savage法除蛋白、活性炭脱色后，选择不同的乙醇浓度，静置一定时间，以分步沉淀和一次沉淀两种方法分别进行醇沉，结果见图5～6。
        从图5和图6可以看出，在分步沉淀中，用低浓度乙醇沉淀时，土茯苓粗多糖的得率较低，沉淀出的主要是高分子量的多糖；用中等浓度乙醇沉淀时，粗多糖的得率较高，沉淀出的主要是中等分子量的多糖；而用更高浓度的乙醇沉淀时，粗多糖的得率又较低，沉淀出的主要是较小分子量的多糖和低聚糖，由此可以初步的观查出土茯苓不同级别糖的组分。在一次沉淀中，土茯苓粗多糖的得率随乙醇浓度的增加而增加。两种沉淀方法中沉淀出来的土茯苓粗多糖中土茯苓多糖的含量变化不大，均在39％左右。
       2.4  验证实验以上实验得出土茯苓多糖的最佳提取工艺为：原药分别用石油醚、80％乙醇各提取两次，第1次20倍体积2 h，第2次10倍体积1 h，抽滤，滤渣真空干燥后在1∶30的固液比、800W的微波功率、100℃提取温度下微波萃取两次，10 min/次。提取液浓缩至原体积的1/5～1/6，加入乙醇后使溶液中乙醇的浓度约为90%，静置过夜后抽滤、真空干燥即得粗多糖。为考查上述提取工艺的稳定性，按该最佳工艺提取3批产品，分别测定土茯苓粗多糖的得率、粗多糖中土茯苓多糖含量，3次实验结果见表4。表4  工艺验证实验结果（略）
        由验证实验结果可知，由正交设计实验优选的提取工艺以及醇沉工艺稳定可行。
       3  结论
        土茯苓多糖最佳提取工艺条件为：固液比1∶30,微波功率800W，提取温度100℃，微波萃取两次，10 min/次，提取液浓缩至原体积的1/5～1/6，终浓度为90%乙醇醇析。
        由单因素实验可知，在用水提取土茯苓多糖的同时，相当大的一部分土茯苓总黄酮也被浸出，经测定其浸出率达到0.19％（文献［6］报道的为0.232％），这就使得土茯苓中有效成分的总浸出率得到提高，有利于中药土茯苓资源的有效利用。
        按优化后的提取工艺条件，以预处理过的20 g干燥的土茯苓饮片进行实验，土茯苓多糖提取率、粗多糖得率和粗多糖中多糖含量分别为8.33％，3.97％和39.5％，优于传统加热水煎煮法（固液比1∶20，提取温度100℃，提取3次，1.5 h/次）的8.02％，3.54％和34.6％。可见，微波辅助提取法大大缩短了提取时间，显著提高了土茯苓多糖的提取效率。
       【参考文献】
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