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       【摘要】 
       目的观察青刺果黄酮（FPR）对糖尿病小鼠肝组织病理变化的影响。方法用四氧嘧啶腹腔注射建立糖尿病小鼠模型，给予青刺果黄酮（300 mg·kg－1）灌胃治疗，连续4周。分别于2周和4周末各组随机抽取4只处死，取肝脏称重，然后用4％的多聚甲醛固定。肝组织石蜡切片，HE染色，显微镜观察。结果糖尿病（DM）小鼠肝脏指数显著增加，肝细胞失去正常的索状结构, 肝窦变窄，肝细胞索之间纤维细胞增生。肝细胞肿胀，发生颗粒变性, 中央静脉周围的肝细胞发生脂肪变性，严重者，肝细胞出现多灶性坏死灶,坏死灶内细胞核浓缩、碎裂、溶解，淋巴细胞和中性粒细胞浸润。中央静脉和小静脉淤血。FPR治疗组，肝脏指数显著降低，肝细胞的索状结构清楚，肝窦较正常，肝细胞呈轻微的颗粒变性。结论FPR能抑制糖尿病小鼠肝脏肿大，减轻肝脏组织病理变化，有效延缓糖尿病引起的肝脏损伤。
       【关键词】  青刺果黄酮 糖尿病 肝脏 组织形态
       Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of flavonoids from Prinsepia utilis Royle on the histomorphology of liver in diabetic mice.MethodsDiabetic mice induced by alloxan were given flavonoids from prinsepia utilis royle orally 300 mg·kg－1 each day for four weeks. Two weeks and four weeks later four mice in each group were randomly sacrificed, livers were taben out and the weights were measured,and then fixed with 4％ polyoxym ethylene. The hepatic tissue was embedded with paraffin, sectioned,and stained with Hematoxylin and Eosin(HE), the histopathology was observed with microscope～ResultsCompared with normal control group, as for the model control group,hepatic index of mice markedly increased, liver cell cords were disordered or disappeared, liver antrum became more narrow, fibrocytes proliferated between liver cell cords; hepatic cells were swollen and developed granular degeneration, hepatic cells around central vein developed fatty degeneration,some serious, hepatic cells appeared many necrotic areas, cellular nucleus concentrated, fragmentated, dissolved in necrotic areas, lymphocytes and neutrophils infiltrated in necrotic areas; central vein and small vein stagnanted blood.While compared with model control group, in the treatment group,hepatic index of mice markedly decreased, liver cell cords clear, liver antrum almost recovered to normal, hepatic cells developed slightly granular degeneration.ConclusionFlavonoids from Prinsepia utilis Royle can inhibit hepatic hypertrophy,relieve the changes of hepatic pathology,and delay the progression of injury of liver induced by diabetes mellitus.
       Key words:Flavonoids from Prinsepia utilis Royle；  Diabetes mellitus；  Liver；  Histomorphology
        糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以糖代谢紊乱为主体，多种物质代谢系统紊乱并伴有多脏器损伤的全身性疾病，其长期的高糖、高脂血症是造成机体脏器损伤的重要原因。糖尿病慢性并发症不仅包括肾脏、心脏、视网膜、神经病变，肝脏亦为长期高血糖累及的靶器官之一，糖尿病的持久性高血糖状态能导致肝脏病变［1］，随着糖尿病病程的延长，发生肝脏病变的危险性及严重性也将随之增加，因此，糖尿病状态下的肝脏病变已越来越引起人们的重视［2～4］。近年来大量研究证明，许多黄酮类化合物在治疗糖尿病及其并发症方面疗效显著，如葛根 、淫羊藿、桑叶 、芹菜 、黄芩 、番石榴等植物黄酮提取物［5］。
        青刺果Prinsepia utilis Royle.，中文学名总花扁核木，李亚科扁核木属植物，落叶灌木［6］，在《滇南本草》中称为青刺尖，云南曲靖地区称为枪刺果，丽江纳西族称为阿拉斯；产于云南、贵州、重庆、四川和西藏。青刺果平均出油率为28％，果油富含人体需要的多种营养成分，是一种高级的天然食用油，并对治疗高血脂，降低胆固醇，防治心血管疾病均有重要的辅助作用［7］。青刺果黄酮(flavonoids from Prinsepia utilis Royle ,FPR）是从青刺果中提取出的活性成分，通过动物实验发现其具有明显的降血糖作用，为了探讨其对糖尿病小鼠肝组织病理变化的影响，进行了以下研究。
       1  材料
       1.1  动物ICR小鼠，♂，体重（23±2）g,购于四川省医学科学院实验动物研究所。小鼠分笼饲养，室温(22±1)℃，相对湿度(60±5)％，喂普通鼠饲料，自由饮水。
       1.2  受试药品及试剂青刺果黄酮（flavonoids from Prinsepia utilis Royle，FPR），由本实验室从青刺果中提取得到，临用前用0.2％的羧甲基纤维素钠配成含青刺果总黄酮15mg/ml的混悬液；四氧嘧啶（alloxan, ALX,Sigma公司)，临用前将四氧嘧啶用生理盐水配成7.5％的注射液。
       1.3  仪器Lelca切片机（Germany）；Nikon生物显微镜（日本）；Nikon照相机（日本）；数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。
       2  方法
       2.1  糖尿病模型的建立小鼠先适应性喂养3 d后，禁食12 h，自由饮水，每只小鼠按200 mg·kg－1腹腔一次性注射ALX制作DM小鼠模型。注射后第4天测空腹血糖，空腹血糖值大于10.00 mmol· L－1者纳入糖尿病模型［8～9］。
       2.2  动物分组及给药将糖尿病模型小鼠随机分为：模型对照组（model control group ，DM组）（不治疗组）；青刺果黄酮组（Flavonoids from Prinsepia utilis Royle group, FPR组）；同时另设一个正常组（normal control group ，NC组）；每组每天喂普通鼠饲料，自由饮水。青刺果黄酮组以剂量300 mg·kg－1,灌胃给药1次/d，模型对照组和正常组灌胃生理盐水1次/d，连续4周。
       2.3  样品的采集和处理实验2周和4周末，各组随机抽取小鼠4只，称重后，断颈放血处死小鼠，迅速剖腹取出肝脏，滤纸吸净残余血液后，称电子天平称肝脏重，然后将部分肝脏置于4％多聚甲醛中固定，常规方法制片， HE染色，光镜下观察肝脏病理变化。
       2.4  统计学处理数据用 ±s表示，所有数据用SPSS13.0统计软件包处理，组间比较用Duncan法检验。
       3  结果
       3.1  青刺果黄酮对糖尿病小鼠肝脏脏器指数的影响DM组小鼠的肝重及肝脏指数显著高于NC组小鼠，FPR组肝重在4周末显著低于DM组，FPR组的肝脏指数显著低于同时间的DM组小鼠。说明FPR能降低糖尿病的肝脏指数。结果见表1。表1  糖尿病小鼠肝脏指数的变化（略）
       3.2  青刺果黄酮对糖尿病小鼠肝组织病理学变化的影响
       3.2.1  剖检变化NC组肝脏正常，外观光滑、湿润，边缘锐利，分叶清晰，大小正常，质地软而富有弹性；DM内脏黏连非常严重，肝脏肿大，色泽暗红，质地变脆，肝缘变钝，小叶融和，分叶不明显。FPR组小鼠的上述病变随治疗时间的延长而减轻。
       3.2.2  镜下观察
        NC组：正常肝组织（见图1）。
        DM组：2周末，肝细胞失去正常的索状结构，肝细胞肿胀，发生颗粒变性。肝窦变窄，肝细胞索之间可见少量纤维细胞增生。中央静脉轻度淤血，血管周围有少量炎性细胞浸润（见图2）。中央静脉周围的肝细胞质内充有大小不等的圆形脂滴，呈脂肪变性（见图3）。4周末，肝细胞的索状结构完全消失，肝细胞肿胀加重，肝窦变窄，肝细胞索之间纤维细胞增生增多，中央静脉和小静脉淤血较严重（见图4），严重者，肝细胞出现多灶性坏死灶,坏死灶内细胞核浓缩、碎裂、溶解，淋巴细胞和中性粒细胞浸润（见图5）。
        FPR组：2周末，肝细胞的索状结构较清楚，肝细胞肿胀变圆，肝窦较窄，肝细胞索之间可见少量淋巴细胞浸润和纤维细胞增生（见图6）；4周末，肝细胞的索状结构清楚，肝窦较正常, 肝细胞呈轻微的颗粒变性（见图7）。
       4  讨论
        肝脏是糖代谢最主要的器官之一，主要是通过促进糖原合成及葡萄糖利用、抑制糖异生等途径使血糖降低，而肝脏的糖代谢主要是在胰岛素的诱导下完成的。ALX诱导的DM小鼠体内胰岛素水平明显下降，因此，糖尿病小鼠肝脏糖代谢出现紊乱，糖原合成降低、葡萄糖利用减少、糖异生加强，导致血糖升高。本次实验，我们采用腹腔一次性注射四氧嘧啶200 mg·kg－1造DM模型，注药后72 h绝大部分小鼠空腹血糖均高于10.00 mmol· L－1，符合文献报道［8,9］，且成模后小鼠血糖持续稳定在高水平状态，无自发性缓解趋势，说明糖尿病模型是成功的。
       
       本次实验发现ALX所造成的糖尿病小鼠肝脏明显肿大，表现为DM组
       小鼠的肝脏指数显著高于NC组。糖尿病模型小鼠经FPR治疗后，其肝脏指数均显著低于DM组。调查显示，糖尿病性肝肿大发生率高，有报道为12％～90％，若长期得不到控制，将会向肝硬化发展。肝肿大是肝脏损害的主要病变之一［10］。肝脏指数是衡量肝脏肿大的客观指标，它可排除个别体重较大的动物具有较大肝脏的个体差异，以及每个动物本身的肝脏随周龄增加而增长的因素，使表示肝重增长的参数比较客观。FPR能降低糖尿病模型小鼠的肝脏指数，说明FPR能抑制肝脏肿大。文献报道［11］，血糖控制良好的糖尿病病仅有9％有肝肿大，而未控制的则为60％。以往的研究认为DM肝肿大主要原因是因为肝细胞内脂肪或糖原堆积所致［12,13］。本实验观察到DM小鼠肝细胞内充有大小不等的脂滴，说明此模型小鼠肝肿大的原因是肝细胞内脂肪堆积所致。DM引起脂肪肝的原因是:高血糖引起脂代谢异常，周围脂肪组织分解亢进，血脂增高，进入肝脏的游离脂肪酸增多，超出肝脏的清除能力，肝内脂肪蓄积出现脂肪肝。FPR抑制肝脏肿大的原因可能与其降血糖作用有关，前期，我们已经对FPR进行了降糖试验，在“青刺果黄酮对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的降糖作用”这篇文章中报道了FPR具有良好的降糖效果，FPR通过降血糖使游离脂肪酸减少，肝细胞内基本无脂滴堆积，肝肿大明显得到缓解。
        DM小鼠的肝脏在4周末出现明显的多灶性坏死灶并伴有大量炎性细胞浸润，其原因可能与DM状态下自由基增多有关。高糖状态下组织内葡萄糖自身氧化，及蛋白非酶促糖基化形成糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）的过程中产生大量的自由基。肝脏富含超氧化物歧化酶，能有效清除机体内产生的自由基而阻止或抑制脂质过氧化反应，然而蛋白质的非酶促糖基化使清除自由基的酶失活，自由基清除能力减弱。自由基生成量的增加及自由基清除能力减弱，导致肝细胞膜和肝细胞线粒体必然受到自由基的损伤［14］，生物膜是由含不饱和脂肪酸的脂质和蛋白质组成，细胞膜和细胞器均为生物膜性结构。当大量自由基作用于膜磷脂中的不饱和脂肪酸则发生脂质过氧化反应，使具有调节膜流动性的不饱和脂肪酸减少，膜流动性降低，而饱和脂肪酸则使膜变坚硬。线粒体膜的损伤又引发呼吸链酶失活，H+-ATPase结构的完整性受到破坏，合成能力下降，肝细胞由于能量供应不足而发生坏死。脂质过氧化反应还可引起膜通透性增加，致大量细胞外Ca2+内流，造成线粒体肿胀、溶酶体的释放。自由基还可造成蛋白质变性失活，核酸和染色体的破坏致细胞坏死。此外，自由基还通过激活磷脂酶，催化膜磷脂释放对白细胞具有趋化作用的花生四烯酸和血小板活化因子，从而使白细胞在局部大量聚集加重炎症。另外，脂滴堆积在肝细胞内也可造成肝细胞进一步坏死［15］。FPR能使坏死灶愈合，其原因可能与降血糖作用有关，通过降低血糖减少自由基和游离脂肪酸的产生，从而减少自由自和游离脂肪酸对肝细胞的损害，其具体机制还有待研究。
       
       本次DM模型小鼠肝脏另一主要病变是纤维细胞增生，经FPR治疗后，纤维细胞有所减少。目前认为高血糖对促进肝纤维化有重要的作用［16～18］。高血糖引起的糖基化终末产物形成，从而导致一系列细胞因子产生，如结缔组织生长因子(connective tissue growth factor CTGF)，转化生长因子-β（TGF- β），由这些细胞因子促进肝脏的纤维化。高血糖症可引起纤维母细胞CTGF表达上调，从而促进肝纤维化［19］。TGF- β可以特异地诱导CTGF的产物而诱导纤维化［20］。另外，高血糖能引起氧化应激，氧化应激通过产生一系列炎症介质，诱导CTGF产生而促进肝脏纤维化［21］。FPR减少纤维细胞增生的原因可能与降血糖作用有关，通过降血糖减少细胞因子的产生，从而减少纤维细胞的增生，具体属于哪种机制还有待进一步研究。
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