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       【摘要】 
       目的运用分光光度法检测黄芩苷作用白色念珠菌后,其琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素C氧化酶（CCO）、Ca2+-Mg2+ -ATPase活性的改变，以探讨黄芩苷抗白色念珠菌作用靶位，为探索中药活性成分抗真菌作用机理提供依据。方法收集经黄芩苷作用了相应时间的白色念珠菌，制备菌悬液，反复冻融研磨，差速离心法提取白色念珠菌线粒体；Lowry法检测线粒体蛋白质含量；分光光度法检测SDH酶、CCO酶、Ca2+-Mg2+ -ATPase活力。结果①0.25，0.5，1 mg/ml黄芩苷浓度组白色念珠菌SDH活力明显低于0 mg/ml黄芩苷浓度组(P＜0.05)，且出现黄芩苷浓度越高SDH活力越低的趋势。不同作用时间组间白色念珠菌SDH活力差异无统计学意义(P＞0.05)。②白色念珠菌经不同浓度黄芩苷作用不同时间后，其CCO酶活力均无明显差异(P＞0.05)。③0.25，0.5，1 mg/ml黄芩苷浓度组与0 mg/ml黄芩苷浓度组比较， Ca2+-Mg2+ -ATPase活力差异显著，黄芩苷浓度越高，Ca2+-Mg2+ -ATPase活力越低，作用时间对Ca2+-Mg2+ -ATPase活力没有明显影响(P＞0.05)。结论①黄芩苷具有明显的抗白色念珠菌作用；②黄芩苷可降低白色念珠菌SDH酶活力；③黄芩苷对白色念珠菌CCO酶活力未见明显影响；④黄芩苷可降低白色念珠菌Ca2+-Mg2+ -ATPas
       【关键词】  黄芩苷 白色念珠菌 抗真菌
       Abstract:ObjectiveTo investigate the target site of baicalin against Candida albicans and supply base for exploring antifungal action mechanism of the traditional Chinese medicine active component by detecting the effect of baicalin on succinate dehydrogenase, cytochrome-oxydase, Ca2+-Mg2+-ATPase through absorption spectrometry.MethodsAfter incubated with different concentrations of baicalin for corresponding time, Candida albicans was harvested and resuspended in physiological saline，which was followed by freeze thawing and grind three times. Then mitochordria was extracted by different centrifugation and used as sample. Lowry method was applied to detect the protein content and absorption spectrometry was used to detect the activities of SDH，CCO，Ca2+-Mg2+-ATPase.ResultsIt was showed that ① the activity of SDH of Candida albicans in control group was much higher than that of Candida albicans treated with baicalin at three doses of 0.25 mg/ml,0.5mg/ml,1mg/ml,while no difference was observed among the three doses. ②No difference was observed in the activity of CCO of Candida albicans treated with different doses of baicalin(P>0.05) for different action time. ③The activity of Ca2+-Mg2+ -ATPase decreased significantly in baicalin groups while compared with that in control group,the higher the concentration of baicalin was ,the lower the activity of Ca2+-Mg2+-ATPase was.Conclusion① Baicalin has significant antifungal effect on Candida albicans;② baicalin can decrease the activity of SDH of Candida albicans;③ baicalin has no effect on the activity of CCO of Candida albicans;④ baicalin can decrease the activity of Ca2+-Mg2+-ATPase of Candida albicans.
       Key words:Baicalin;  Candida albicans;  Antifungal mechanism
        黄芩苷是古老中药黄芩的主要有效成分，药理作用广泛，不但具有抗炎、解热、镇静、降压、利尿、利胆、保肝以及调节免疫等作用［1～5］，而且具有良好的抗真菌作用［6］。目前对黄芩苷的大部分研究集中在药效和药理实验方面，鲜见作用机制的研究报道；而探索黄芩苷的抗真菌作用机理,能够为这种传统中药的抗真菌作用提供可以量化的现代医学指标，有利于中药的高附加值开发及现代化、国际化进程，并为发现和研制更理想的抗真菌药物提供有益的线索和理论依据。
        本实验运用分光光度法，检测黄芩苷作用白色念珠菌后其琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素C氧化酶（CCO）、Ca2+-Mg2+ -ATPase活性的变化，以探讨黄芩苷抗白色念珠菌作用靶位，为探索中药活性成分抗真菌作用机理提供依据。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  菌株白色念珠菌标准株（22086），购自中国预防医学科学院。
       1.1.2  试剂及仪器黄芩苷 (江西省中医药研究所提供，纯度≥98%)；马心细胞色素C（Sigma公司）；牛血清白蛋白(Sigma公司);RPM11640粉(美国Gibco公司):琥珀酸脱氢酶（SDH）测试盒和超微量ATP酶测试盒（均购自南京建成生物工程研究所）；紫外分光光度计(上海分析仪器总厂);28RS型高速低温离心机(德国Heraeus公司);05PR-22型低速冷冻离心机(日立工机株式会社)。
       1.2  方法
       1.2.1  实验设计采用2因素4水平析因实验设计，2因素为黄芩苷浓度、作用时间；黄芩苷浓度有0,0.25,0.5,1 mg/ml 4水平，作用时间为6，12，24，48 h四水平。
       1.2.2  线粒体的分离取培养至对数生长期调整为一定浓度的白色念珠菌菌液，根据实验设计，分别加入相应浓度的黄芩苷，35℃培养相应时间后,无菌生理盐水洗涤2次，每次1 000 r/min离心5 min。去上清，沉淀用无菌生理盐水混悬，调整浓度为1×107CFU/ml。菌液-15～-20℃冷冻，室温迅速融化并置于研钵中，研磨5～15 min，如此反复冻融研磨3～5次，制成匀浆。取0.34 mol/L的蔗糖溶液4.5 ml置干净离心管中，沿管壁缓缓加入4.5 ml白色念珠菌匀浆覆盖于上层，2 800 r/min离心5 min以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片，上清移至另一干净离心管中，17 000 r/min离心15 min，弃去上清，缓冲液重悬沉淀部分，即得线粒体样品。
       1.2.3  蛋白质含量测定采用Lowry法。
       1.2.4  SDH酶、Ca2+-Mg2+-ATPase活力分析使用白色念珠菌线粒体检测SDH酶活力，匀浆检测Ca2+-Mg2+-ATPase活力，操作严格按试剂盒说明进行。
       1.2.5  CCO酶活力检测根据文献方法，测定样品含100 mmol／L，pH 7.0磷酸缓冲液1.5 ml，线粒体悬液0.1 ml(含线粒体蛋白50 μg)，加蒸馏水至2.9 ml，30℃温育2 min。加入还原型细胞色素C 0.1 ml。用分光光度计直接测定还原型细胞色素C被氧化的速度，计算CCO活力。
       2  结果
       2.1  白色念珠菌经黄芩苷作用后琥珀酸脱氢酶（SDH）活力的变化10 mg/ml黄芩苷浓度组白色念珠菌SDH比活力为8.532 U/mgprot,显著高于其它黄芩苷浓度组（0.25，0.5，1 mg/ml）(P＜0.05)，且出现黄芩苷浓度越高SDH活力越低的趋势,见图1。
       2.2  白色念珠菌经黄芩苷作用后细胞色素氧化酶（CCO）活力的变化白色念珠菌经不同浓度黄芩苷作用后，细胞色素氧化酶（CCO）活力无明显差异(P＞0.05)；各作用时间组之间白色念珠菌细胞色素氧化酶活力差异无统计学意义(P＞0.05)；黄芩苷浓度、作用时间之间不存在交互作用。
       2.3  白色念珠菌经黄芩苷作用后Ca2+-Mg2+-ATPase活力的变化0.25,0.5,1 mg/ml黄芩苷浓度组Ca2+-Mg2+-ATPase活力分别为8.804,8.220,6.411 U/gHb,明显低于0 mg/ml黄芩苷浓度组(P＜0.05)，且呈现出黄芩苷浓度越高，Ca2+-Mg2+-ATPase活力越低的趋势，不同作用时间之间Ca2+-Mg2+-ATPase活力差异不明显(P＞0.05)，见图2。
       3  讨论
        线粒体(mitochondria)是细胞呼吸的主要场所，氧化磷酸化的重要装置，在维持细胞正常的能量代谢、结构和功能方面具有重要作用。线粒体功能的发挥与内膜及基质中酶的活性密切相关。许多抗真菌药物的作用靶点针对线粒体及其酶类，Lunde CS报道［7］水蓼二醛为天然倍半萜戊二醛，可抑制线粒体ATP合成酶，消除真菌细胞中ATP的主要来源，导致胞内ATP含量下降，不能维持正常代谢而死亡。罗曼等［8］应用生物化学方法并结合扫描电镜,观察了柠檬醛作用黄曲霉后线粒体形态的变化,并研究了柠檬醛对黄曲霉细胞线粒体氧化还原酶类以及对线粒体呼吸速率的影响,结果显示,柠檬醛处理组线粒体发生不规则增加,形态不规则,结构无序,表面粗糙;同时线粒体氧化还原酶如琥珀酸脱氢酶活性、苹果酸脱氢酶的活性(以NADP+ 或NAD+ 为辅酶时) 以及线粒体呼吸速率均较对照组明显降低,认为柠檬醛一方面减少能量合成和利用,同时还通过降低NADPH合成量而减少还原力,不可逆地抑制核酸、蛋白质、脂类及糖的合成而导致细胞死亡。生化实验表明，黄芩苷能够降低白色念珠菌线粒体SDH酶的活力，黄芩苷浓度越高，SDH酶活力越低，但黄芩苷似乎对细胞色素C氧化酶活力没有影响，有报道［9］称，SDH活性变化与线粒体的损伤同时出现，与线粒体的数目平行升降,并直接影响氧化磷酸化过程。因此，黄芩苷可能通过影响SDH酶活力，损伤白色念珠菌线粒体，抑制白色念珠菌生长。
        Ca2+-Mg2+-ATPase是细胞膜上的Ca2+泵, 它可以水解ATP, 使细胞内Ca2+泵到细胞外, 以维持细胞内相对较低的Ca2+浓度, 这是维持细胞稳态的重要机制之一, 也是细胞功能得以正常发挥的基础。念珠菌质膜ATPase的存在最早由Matile ［10］提出，并被Eddy和Indge ［11］实验证实，1975年Marriot［12］证实了白色念珠菌ATPase的存在。本研究表明，白色念珠菌经黄芩苷作用后，Ca2+-Mg2+ ATPase活力降低，且在本实验浓度范围内，黄芩苷浓度越高，ATPase活力越低。Ca2+-Mg2+-ATPase活力降低必然影响Ca2+泵的功能，影响细胞内Ca2+平衡，甚至导致胞内Ca2+超载。胞内Ca2+超载也可引起细胞凋亡，后续实验中我们在1 mg/ml黄芩苷作用48 h的白色念珠菌中发现了凋亡现象，但与Ca2+-Mg2+-ATPase活力降低之间是否有直接关系还有待探讨。
       【参考文献】
         　　［1］Chou TC,Chang LP,LiCY et al. The antiinflammatory and analgesic effects of baicalin in carrageenan-evoked thermal hyperalgesia［J］.Anesth Analg，2003 ,97(6):1724.
       
       ［2］Miocinovic R, McCabe NP, Keck RW， et al. In vivo and in vitro effect of baicalein on human prostate cancer cells［J］.Int J Oncol，2005,26(1):241.
       
       ［3］Ciesielska E, Gwardys A, Metodiewa D. Anticancer, antiradical and antioxidative actions of novel Antoksyd S and its major components, baicalin and baicalein［J］.Anticancer Res，2002，22(5):2885.
       
       ［4］Woo AY,Cheng CH,Waye MM. Baicalein protects rat cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation damage via a prooxidant mechanism［J］.Cardiovasc Res, 2005 ,65(1):244.
       
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       ［6］熊 英，傅颖媛，况南珍,等.黄芩苷抗白色念珠菌作用及机制研究［J］.中国药理学通报, 2004,20(12):1404.
       
       ［7］Lunde CS, Kubo I. Effect of polygodial on the mitochondrial ATPase of Saccharomyces cerevisiae［J］.Antimicrob Agents Chemother. 2000 ，44(7):1943.
       
       ［8］罗 曼，蒋立科.柠檬醛损伤黄曲霉线粒体生化机理的研究［J］.微生物学报,2002,42(2):226.
       
       ［9］Wu Y,Liu C,Chen Q.Effect of acupuncture on enzymology of motor neuron anterior bom of experimental spinal cord injury in rats［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jiehe zazhi，1999，19(10):740.
       
       ［10］Matile P, Moor H, Muhlethaler K. Isolation and properties of the plasmalemma in yeast［J］.Arch Mikrobiol，1967，58(3):201.
       
       ［11］Eddy AA, Indge KJ, BackenInterctions K.et al. between potassium ions and glycine transport in the yeast Saccharomyces carlsbergensis［J］.Biochem J，1970，120(4):845.
       
       ［12］marriott ms. Enzymic activity of purified plasma membranes from the yeast and mycelial forms of Candida albicans［J］.J Gen Microbiol，1975，89(2):345.