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       【摘要】 
       目的采用超声辅助提取，建立高效液相色谱-光电二极管阵列检测法测定柿蒂中乌索酸和齐墩果酸的含量。方法 色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶水∶磷酸（体积比87∶13∶0.1），流速0.8 ml·min-1，检测波长210 nm，柱温28 ℃。结果乌索酸进样量在0.359～5.744 μg时，与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999），平均回收率为98.3 %， RSD为2.0 %(n=6)；齐墩果酸在0.174～2.784 μg时，与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999），平均回收率为99.6 %，RSD为2.5 %(n=6)。结论 方法操作简便、快速、准确，可用于柿蒂中乌索酸和齐墩果酸含量的测定。
       【关键词】  反相高效液相色谱法 柿蒂 乌索酸 齐墩果酸 光电二极管阵列检测器
       Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC method with photodiode array detector(PAD) for the determination of ursolic acid and oleanolic acid in Diospyros kaki by ultrasowithnic wave aided method. MethodsThe separation was achieved on a Kromasil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 28 ℃ using methanol-H2O-phosphoric acid (87∶13∶0.1,V/V) as the mobile phase at a flow rate of 0.8 ml·min-1,  the detection wavelength was 210 nm. ResultsUrsolic acid showed good relationship at the range of 0.359～5.744 μg (r=0.999). The recovery was 98.3 % and RSD was 2.0 %. Oleanolic acid showed good relationship at the range of 0.174～2.784 μg (r=0.999). The recovery was 99.6 % and RSD  was 2.5 %.ConclusionThe proposed method is simple, rapid and accurate. It can be used to determine the contents of ursolic acid and oleanolic acid in Diospyros kaki.
       Key words:HPLC;   Diospyros kaki;   Ursolic acid;   Oleanolic acid;   Photodiode array detector
        柿蒂Diospyros kaki Thunb.，别名为柿丁，为柿科植物柿的干燥花萼，主产于四川、广东、广西、福建等地。其味苦、性温，有降气止呃功能，常用于胃寒气滞的呃逆。临床治疗顽固性或术后呃逆，反流性胃炎等症［1］。《中国药典》2005版仅有柿蒂中没食子酸的薄层鉴别方法，而无含量测定项［2］。文献报道了高效液相色谱测定柿蒂中没食子酸［3］,金丝桃苷和齐墩果酸等［4］有效成分含量的方法，但同时测定柿蒂中乌索酸和齐墩果酸含量的文献至今未见报道。本文采用超声辅助提取，建立高效液相色谱法对柿蒂中的乌索酸与齐墩果酸的含量进行了测定，为柿蒂的质量评价及其有效成分的检测提供科学依据。
       1  材料与试剂
        Waters高效液相色谱仪（515泵，2996光电二极管矩阵检测器，7725I 进样阀，Empower 中文色谱工作站），RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)，CP225D分析天平（德国Sartorius公司），FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，202-26A型数显电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)，KS-1500超声提取仪器(宁波科盛仪器厂)。
        甲醇为色谱纯（色谱纯，上海陆忠试剂厂），水为高纯水，95%乙醇（分析纯，江西同盟试剂化工厂），乌索酸和齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110742-200314，110709-200304，供含量测定用）。柿蒂购于药材市场，经鉴定为柿科植物柿的干燥花萼Diospyros kaki Thunb.。
       2   方法与结果
       2.1   色谱条件
       色谱柱为Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水∶磷酸（体积比87∶13∶0.1）；流速0.8 ml·min-1；检测波长210 nm；柱温为28℃。外标法定量分析，乌索酸和齐墩果酸理论塔板数大于13 500，分离度分别为1.83和1.99，拖尾因子分别为1.01和1.04。对照品和样品色谱见图1。
       2.2  峰纯度分析
       从光电二极管检测器采集的样品三维图谱中提取紫外光谱和不同波长的色谱进行对比，检测波长为210 nm时色谱峰信噪比高，峰形对称，分离度达到色谱方法的定量要求［5］。采用Empower色谱软件适应性模块对此波长的色谱峰进行纯度分析，对照品和样品中乌索酸和齐墩果酸色谱峰的纯度角值均小于阈值，纯度角线均位于自动阈值线下方，证实色谱峰为单一组分吸收峰。乌索酸和齐墩果酸的色谱峰纯度分析见图2。
       2.3  溶液配制
       2.3.1  对照品溶液
       分别精密称定乌索酸、齐墩果酸对照品3.59 mg和1.74 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品混合溶液，备用。
       2.3.2  样品溶液 
       
       取于80 ℃干燥并粉碎过20目筛的柿蒂粉末约3 g，分别置于50 ml具塞锥形瓶中，用95 ％乙醇40 ml超声提取90 min，过滤，残渣用乙醇洗涤，合并滤液，定容至50 ml量瓶中，摇匀，作为样品溶液。
       2.4  线性关系试验
       分别精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液中1，4，8，12，16 μl进样分析，按色谱条件测定峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积(μV·s)为纵坐标，进行线性拟合，得乌索酸线性回归方程为：Y=6.44×105X-5.83×104（r=0.999），齐墩果酸线性回归方程为：Y=7.54×105X-3.70×104(r=0.999)。表明当乌索酸进样量在0.359～5.744 μg；齐墩果酸进样量在0.174～2.784 μg时，线性关系良好。
       2.5  精密度实验
       分别精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液10 μl进样，平行5次，测定峰面积。乌索酸和齐墩果酸峰面积RSD分别为0.2 %(n=5)和0.6 %(n=5)。表明进样方法和仪器精密度良好。
       2.6  重现性实验
       取同批柿蒂样品5份，每份各约3 g，按样品溶液制备方法制备样品溶液。精密吸取各样品溶液10 μl，进样，测定乌索酸和齐墩果酸峰面积，外标法计算含量。乌索酸含量RSD为1.8 %（n=5），齐墩果酸含量RSD为2.3 %（n=5）。样品处理方法重现性良好。
       2.7  加样回收率实验
       精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量的柿蒂叶样品6份，每份约3 g，按高、中、低3种浓度分别加入乌索酸和齐墩果酸对照品适量，制备样品溶液，进样测定样品中乌索酸和齐墩果酸的含量。乌索酸平均加样回收率为98.3%，RSD为2.0 %（n=6）；齐墩果酸平均回收率为99.6 %，RSD为2.5 %（n=6）。
       2.8   样品含量测定 
       精密吸取不同的柿蒂样品溶液10 μl进样，平行3次，测定乌索酸和齐墩果酸峰面积积分值，外标法计算柿蒂样品中乌索酸和齐墩果酸的平均含量。结果见表1。表1  柿蒂不同部位中乌索酸和齐墩果酸含量测定结果（略）
       3  讨论
        测定结果表明，不同柿蒂样品中两种三萜酸成分的含量较高，为药材的主要活性成分。但乌索酸和齐墩果酸含量存在差异，且乌索酸含量均明显高于齐墩果酸，约为齐墩果酸的2.8～2.9倍，2组分含量的相对值基本稳定。
        考察了Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Nucleodur C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Nova-Pak C18（3.9 mm×300 mm，4 μm）3种色谱柱对同分异构体乌索酸和齐墩果酸的分离效果，结果显示不同型号色谱柱对乌索酸和齐墩果酸的分离度有较大的影响，Kromasil柱的分离效果最佳，乌索酸和齐墩果酸达基线分离，分离度为1.9，符合色谱定量分析的要求。
        采用反相高效液相色谱法测定柿蒂中的乌索酸和齐墩果酸的含量，样品处理简单，无其它杂质的干扰，可同时检测待测组分的峰纯度和紫外吸收特征光谱，增强了色谱的定性能力，方法简便、快速，分离效果好，数据准确可靠。
       【参考文献】
         　　［1］肖培根.新编中药志（第二卷）［M］.北京：化学工业出版社,2002：487.
       
       ［2］国家药典委员会.中国药典，Ⅱ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：175.
       
       ［3］王 初,胡晓炜,宋旭峰.反相高效液相色谱法测定柿蒂中没食子酸的含量［J］.医药导报，2005，24(8)：728.
       
       ［4］郑一敏,胥秀英,杨艳红,等.HPLC法测定柿蒂中金丝桃苷与齐墩果酸的含量［J］.药学实践杂志,2005,23(3)：163.
       
       ［5］邹盛勤，陈 武.高效液相色谱- 光电二极管检测器法测定栀子中乌索酸的研究［J］.氨基酸和生物资源,2006，28(4)：77.