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       【摘要】 
       目的研究大孔吸附树脂分离纯化草珊瑚总黄酮工艺，为草珊瑚总黄酮的工业化生产提供实验依据。方法以贵州产草珊瑚为原料，以草珊瑚总黄酮含量及回收率等为考察指标，选用大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮进行分离纯化，分别采用静态试验、动态试验等考察大孔树脂对草珊瑚总黄酮的分离纯化效果及影响因素。结果AB-8型大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮静态饱和吸附量为116.25 mg·g-1（干树脂），洗脱率92.9%，动态饱和吸附量为94.5 mg·g-1（干树脂），总黄酮回收率在96.1%、纯度在90%以上，是实验树脂中分离纯化草珊瑚总黄酮的最佳大孔吸附树脂。结论分离纯化草珊瑚总黄酮最佳工艺条件为：AB-8型大孔吸附树脂，洗脱剂为70%乙醇，洗脱剂用量为3倍树脂体积，流速3～4 ml/min，上柱总黄酮量与树脂比为1∶10.5，上柱液总黄酮浓度为19.8 mg/ml，流速2～3 ml/min，冲洗杂质用水体积2～3 BV，上柱液pH值4～5。
       【关键词】  大孔树脂 草珊瑚 总黄酮 分离 纯化
       Abstract:Objective A method for separation and purification of the flavonoids from Sarcandrae glabra with macroporous resin was studied.MethodsBy using Sarcandrae glabra in Guizhou and with the content and recovery rate of flavonoids as indexes and the static absorption capacity and the static elution ratio were observed. ResultsThe results were as flollows: The static absorption capacity of AB-8 type resin was 116.25 mg·g-1, the static elution ratio was 92.9%, the dynamic absorption capacity of AB-8 type resin was 94.5 mg·g-1, the recovery rate was more than 96.1% and the purity was more than 90%. AB-8 type resin was the best for separating and purificating Sarcandrae glabra in flavonoids.ConclusionThe optimum conditions is: AB-8 type macroporous resin, the eluant is 70% alcohol and 3 times as the volume of the resin, the volume of the resin is 10.5 times of flavonoids in sample,  concentration of flavonoids of sample is 19.8 mg·ml-1 and current velocity of 2～3 ml·min-1, pH value of sample is 4～5.
       Key words:Macroporous resin；  Sarcandrae glabra；  Flavonoids；  Separation；  Purification
        草珊瑚Sarcandra  glabra ( Thunb. ) Nakai为多年生常绿草本或亚灌木，系金粟兰科草珊瑚属植物，药用全草。在我国长江以南各省均有分布，特别是云、贵、川较为多见。草珊瑚叶苦辛、性温、有小毒，有祛风通络、活血祛淤、止血止痛、接骨续筋之功效，民间常用来治疗风湿痹症，跌打损伤等［1］及作茶饮用，已有数百年的历史。现代医学，药理、毒理研究表明草珊瑚具有抗菌消炎，抑制多种病原菌，清热解毒，抗多种肿瘤，促进骨折愈合，改善血液循环，镇痛，抗疲劳，抗氧化，抑制流感病毒等多种生物活性［2］。毒性实验表明草珊瑚及其提取物无毒；动物精子畸性实验，小鼠骨髓细胞微核实验等均为阴性，未发现致突变作用，所以是非常安全的［3，4］。目前，草珊瑚的加工产品有医药、兽药品，保健品，食用品等数十种之多。黄酮类化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的药用有效成分之一［2］。随着草珊瑚在医药、兽药、保健食品及保健用品领域中的应用越来越广泛，而对草珊瑚总黄酮的分离纯化研究尚未见到系统报道。为了更合理地开发利用草珊瑚资源，本研究以草珊瑚总黄酮含量及回收率等为考察指标，选用大孔吸附树脂分离纯化草珊瑚总黄酮，分别采用静态实验、动态实验等考察大孔树脂对草珊瑚总黄酮的分离纯化效果及影响因素，研究分离纯化草珊瑚总黄酮的最佳工艺条件及各种影响因素。从而为生产中最有效的开发利用草珊瑚、发挥草珊瑚的最大经济效益提供实验依据。
       1  材料与仪器
        草珊瑚全草均采自贵州省江口县同一地点，由本院生物技术重点实验室进行鉴定及采用统一的干燥方法加工制样，避免背景干扰。
        所用试剂NaNO2，Al(NO3)3，NaHSO3，NaSO3，EDTA，吐温-80等均为分析纯，乙醇为95%食用酒精，芦丁标准品为美国Sigma公司产品、含量大于98%；大孔吸附树脂： D3520型，AB-8型，NKA-9型，D4020型，S-8型（南开大学化工厂）。
        TU-1800紫外可见分光光度计（北京普析），RE－52旋转蒸发仪（上海亚荣），不锈钢提取锅（武汉立中），PHSJ－3F精密酸度计（上海雷磁），ALG5/10自动灌装封口机（上海国彩），电子天平（美国奥豪斯），恒温水浴箱(上海医疗器械厂)；鼓风干燥箱(上海实验仪器厂)；植株样本粉碎机(上海实验仪器厂)；液体自动混合机（北京长安仪器厂）。
       2  方法与结果
       2.1 草珊瑚总黄酮的测定方法  
       草珊瑚总黄酮的测定方法采用芦丁比色法［5］，测定波长500 nm，回归方程：C=84.317A-0.77361，(r=0.999 8)，吸光度线性范围：0.1～0.6，加样回收的平均回收率99.37%，RSD=1.85%（n=6）；精密度测定RSD=0.95%。
       2.2  草珊瑚总黄酮纯化用样品液的制备取草珊瑚全草（除根）干品粗粉500 g，根据作者已有试验L9（34）正交设计筛选出的草珊瑚总黄酮乙醇浸提最优水平组合工艺：即采用60%乙醇、80℃温度，3 h/次，提取3次进行提取制备，制得草珊瑚总黄酮提取液（总黄酮含量：9.5 mg·ml-1）冷藏备用。
       2.3  大孔吸附树脂的筛选［6～8］将D3520型、AB-8型、NKA-9型、D4020型、S-8型树脂先用4倍体积量95%乙醇或丙酮浸洗均可，至浸洗液加适量蒸馏水无白色浑浊现象时止，用水反复清洗干净至无醇味或无酮味，加入4倍体积量2 mol·L-1的氢氧化钠溶液，浸泡12 h，以水洗至中性；再加入4倍体积量4 mol·L-1的盐酸，浸泡12 h，用蒸馏水洗至中性后60℃烘干备用。
        精密称取经上述预处理的干树脂1 g共3份，置100 ml三角瓶中，精密加入2.2项下制取的样品液20 ml后震荡吸附，頻率120次/min，1分钟间隔振荡2 h，然后静置20 h，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按下式计算树脂饱和吸附量：饱和吸附量=［（初始浓度-吸附后浓度）×吸附液体积］/树脂量（mg·g-1干树脂），取三次平均值。将经静态饱和吸附总黄酮后树脂滤出，吸干表面水分，精密加入60%浓度的乙醇20 ml后同上法震荡2 h后滤出，测定洗脱液总黄酮的浓度，计算洗脱率：洗脱率=［洗脱液浓度×洗脱液体积］/饱和吸附量×100%，取3次平均值。结果见表1。表1  5种树脂对草珊瑚总黄酮的静态饱和吸附洗脱结果（略）
        上述结果表明5种大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮的静态饱和吸附量均在90 mg以上，以AB-8型树脂静态吸附量最大；在静态洗脱中，AB-8型树脂洗脱率为92.9%，高于其它4种，AB-8型树脂表现出最佳的综合性能。
       2.4  洗脱剂浓度的筛选精密称取预处理好的AB-8型干树脂1 g共7份，分别置100 ml三角瓶中，精密加入2.2项下制取的样品液20 ml后按2.3项下同法震荡，使其达到饱和吸附，分离树脂，吸干表面水分。对应加入浓度分别为30%，40%，60%，70%，70%，80%，90%的乙醇各20 ml后同法震荡洗脱2 h后过滤出，测定洗脱液总黄酮浓度，计算洗脱率（算法见2.3项下）。结果见表2及图1。表2   乙醇浓度对AB-8型树脂洗脱率的影响 （略）
        表2表明, 洗脱剂乙醇浓度增高，洗脱率逐渐增大，70%～90%的乙醇洗脱率均在90%以上，而乙醇浓度高易挥发，从经济、安全、节约出发本实验选用70%乙醇为洗脱剂。
       2.5  pH对AB-8型树脂吸附量的影响精密称取已预处理好的干树脂1 g共8份，各置100 ml三角瓶中，精密加入pH3，4，5，6，7，8，9，10样品液各20 ml按2.3项下同法震荡，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按2.3项下公式计算树脂饱和吸附量。结果见表3及图2。表3   pH对AB-8型树脂饱和吸附量的影响（略）
        表3表明，上样液以pH4饱和吸附量最大。
       2.6  AB-8型树脂对草珊瑚总黄酮的动态吸附-洗脱量测定称取已处理好的AB-8型吸附树脂100 g和20 g，分别湿法装入3 cm×500 cm的色谱柱中，将2.2项下制取的草珊瑚提取液330 ml（9.5 mg·ml-1）以2～3 ml·min-1的流速上柱，过柱完后用3倍树脂体积量（3BV，下同）的蒸馏水以3～4 ml·min-1的速度洗柱至洗脱液无色，再用4BV 70%的乙醇以2～3 ml·min-1的洗脱速度洗脱至无色透明，收集70%的乙醇洗脱液，按2.1项下方法测定总黄酮含量，计算动态吸附洗脱量，总黄酮回收率等（回收率＝过柱后总黄酮质量/过柱前总黄酮质量×100%）。结果见表4。表4  AB-8型大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮的动态吸附-洗脱结果（略）
        表4表明，装柱量为100 g的色谱柱总黄酮回收率为96.13%，表明已吸附完全，而每克树脂吸附量为30.3mg，未达饱和。装柱量为20 g的色谱柱总黄酮回收率为60.97%，表明未吸附完全，而每克树脂吸附量为94.5 mg，吸附量已达饱和。其吸附量94.5 mg·g-1（干树脂）即为AB-8型大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮的饱和动态吸附-洗脱量。
       2.7  树脂用量对吸附草珊瑚总黄酮的影响精密称取预处理好的AB-8型干树脂1g共4份，分别置100 ml三角瓶中，按样品液体积与树脂质量比(ml:g)5∶1，10∶1，15∶1，20∶1的比例分别精密加入2.2项下制取的样品液后按2.3项下同法震荡，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，计算吸附率（吸附率＝吸附总黄酮质量/吸附前总黄酮质量×100%）。分离树脂，吸干表面水分，对应加入60%的乙醇各20 ml后同法震荡洗脱2 h后过滤出，测定洗脱液总黄酮浓度，计算总黄酮回收率（算法见2.6项下）。结果见表5。表5  AB-8型大孔吸附树脂用量对吸附草珊瑚总黄酮的影响（略）
        表5表明上样液与树脂比为5∶1～10∶1时吸附率、回收率最高。而5∶1时大孔树脂利用不完全有浪费，以10∶1（总黄酮质量∶树脂质量=1∶10.5）时为最佳用量。
       2.8  样品上柱液浓度对回收率的影响分别称取已处理好的AB-8型吸附树脂450 g共3份，湿法装入5 cm×500 cm的色谱柱中，取草珊瑚浸膏3份，130 g/份（含总黄酮27.8 g），分别按2BV（1 400 ml），3BV（2 100 ml），4BV（2 800 ml）加水溶解过滤后上柱，流速2～3 ml·min-1，分别收集过柱液，测其中总黄酮残留量并计算总黄酮回收率。结果见表6。
        表6表明，上柱液中总黄酮含量相同,而浓度，体积不同（2BV，3BV，4BV）时，对草珊瑚总黄酮吸附量、回收率有影响。4BV上柱液过柱后残液中总黄酮含量最多，损失量（未被吸附量）占总黄酮总量的6.97%；而2BV体积上柱液损失量最小为1.6%，总黄酮回收率最高。由此可见，提高上柱液浓度有利于吸附和节省时间。表6   上柱液浓度对AB-8型大孔吸附树脂吸附草珊瑚总黄酮的影响（略）
       2.9  冲洗杂质用水体积对回收率的影响按2.8试验条件下草珊瑚样品液4份，分别按2BV（1 400 ml）加水溶解过滤后上柱，流速2～3 ml·min-1，过柱完后一份不用水冲洗洗脱，另3份分别用1 BV水（700 ml），2 BV水，3 BV水冲洗后洗脱，分别测定每份过柱水及洗脱剂中总黄酮含量并计算损失量及水冲洗对总黄酮纯度及回收率影响。结果见表7。表7  冲洗杂质用水体积对AB-8型大孔树脂吸附草珊瑚总黄酮的影响（略）
        表7表明，吸附后用水冲洗对已吸附的总黄酮会有一定量的损失，水洗体积越大, 损失量越多，总黄酮回收率降低，但水洗可除去杂质，提高总黄酮纯度。综合各因素, 冲洗杂质用水体积以2～3BV为宜。
       2.10  洗脱剂洗脱次数的确定按2.8实验条件下草珊瑚样品1份，按2BV（1 400 ml）加水溶解过滤后上柱，流速2 ～3 ml·min-1，过柱完后用70%乙醇作洗脱剂，按1BV（700 ml）洗脱，共洗脱5次，收集每次洗脱剂，测定其中总黄酮含量并计算总黄酮回收率。结果见表8及图3。表8  洗脱剂洗脱次数对AB-8型树脂吸附草珊瑚总黄酮回收率影响（略）
        从表8可看出，总黄酮洗脱量主要集中在第1，2，3次，占总黄酮回收率的96.12%。洗脱剂用量为3倍树脂体积比较适宜。
       3  结果与讨论
       3.1  实验表明，5种大孔吸附树脂以AB-8型大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮有较大静态吸附量,为116.25mg.g-1，洗脱率为92.9%，高于其它四种大孔吸附树脂。同时，其动态吸附-洗脱性能也最好，总黄酮回收率为96.13%。综合考虑各因素, AB-8型大孔吸附树脂为分离纯化草珊瑚总黄酮的最佳树脂。
       3.2  分别对影响AB-B型树脂吸附、洗脱的因素进行了考察，研究表明：洗脱剂乙醇浓度增高，洗脱率逐渐增大，70～90%的乙醇洗脱率均在90%以上，而乙醇浓度高易挥发，从经济，节约出发选用70%乙醇即可。上样液pH以4～5时饱和吸附量最大。因黄酮类化合物多具酚羟基，显弱酸性，当上样液pH偏大时，草珊瑚总黄酮有离子化趋势而不易被吸附。因此，上样液pH偏酸有利于吸附。
       3.3  目前，尚未见有大孔吸附树脂分离纯化草珊瑚总黄酮上样浓度的报导，但有报导上样液浓度对吸附量有影响［8］。本研究表明上样液浓度与吸附量呈明显的正相关关系，19.82 mg·L-1吸附量明显高于9.93 mg·L-1，适当提高上样液浓度有利于吸附。上样液浓度以分离的目标产物草珊瑚总黄酮计，可消除草珊瑚药材产地、品种等不同造成的总黄酮含量的差异，有利于保证吸附及减少损失。
       3.4  本研究表明上样液与树脂比为5∶1～10∶1时吸附率、回收率最高。大孔树脂用量与上样液总黄酮浓度要有一合理比例才能达到最佳吸附效果而又不会导致浪费和增加成本。而5∶1时大孔树脂利用不完全有浪费，以10∶1（总黄酮质量:树脂质量=1∶10.5）时为最佳用量。为保证完全吸附，实际生产中总黄酮与树脂比应大于1∶10.5比例，以达到饱和吸附及吸附完全。样品液上柱流速为2～3 ml·min-1；冲洗杂质用水体积2～3 BV，上柱流速为3～4 ml·min-1；洗脱剂用量3 BV，上柱流速为2～3 ml·min-1，即可达到满意效果，总黄酮纯度，回收率均可达90%以上。
       【参考文献】
         　　［1］江苏新医学院. 中药大辞典(上)［M］. 上海：上海科学技术出版社,1997.
       
       ［2］王浴生,邓文龙,薛春生. 中药药理与应用［M］.北京：人民卫生出版社，2000：714.
       
       ［3］夏 勇,傅剑云,徐彩菊. 草珊瑚浸膏的急性毒性和致突变性探讨［J］. 浙江中医学院学报， 1996，20（5）：36
       
       ［4］孙建琴,孙晓红. 草珊瑚的毒性研究［J］. 贵阳医学院学报, 1998，（1）：43.
       
       ［5］郁建生. 分光光度法测定复方草珊瑚注射液中总黄酮含量方法的探讨［J］. 中医医药杂志，2002，（3）：41.
       
       ［6］元英进，刘明言，董岸杰. 中药现代化生产关键技术［M］. 北京: 化学工业出版社，2002：93.
       
       ［7］韩 丽，谢秀琼，周淑芳，等.实用中药制剂新技术［M］. 北：化学工业出版社, 2002：167.
       
       ［8］向大雄,李焕德,朱叶超，等. 大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的研究［J］. 中国药学杂志，2003，38（1）：35.